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生物技术药物制剂生物技术的基本概念生物技术（Biotechnology）是应用生物体（包括微生物、动物细胞、植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。基因工程细胞工程酶工程发酵工程生化工程蛋白质工程抗体工程生物技术药物指采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的药品采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质和核酸类药物，可称为生物技术药物。方便有效大量的生产许多难以从自然界或不可能获得的生物活性蛋白和多肽这些内源性的生理活性物质作为药物应用已有多年的历史，但由于材料来源困难、制造技术问题、造价太高或免疫抗原等缘故，使它们的使用受到限制。干扰素（IFN）白介素（IL）重组人生长激素（hGH）重组人胰岛素反义寡核苷酸核酸疫苗我国已批准上市的生物技术药物产品药物名称适应症批准时间α-1b干扰素（外用）病毒性角膜炎1989α-b干扰素HBV、HCV等1996α-2a干扰素尖锐湿疣、疱疹等1996α-2b干扰素HBV、HCV1996γ-干扰素类风湿1994白细胞介素-2癌症辅助治疗1995粒细胞集落刺激因子化疗升白细胞1997粒细胞巨细胞集落刺激因子化疗升白细胞1997重组链激酶心梗溶栓1996人促红细胞生成素再障贫血1997碱性成纤维细胞生长因子创伤、烧伤1996乙型肝炎疫苗乙型肝炎1992生物技术药物的特征药理活性强，给药剂量小，药物本身毒副作用小药物稳定性差：多为多肽、蛋白质药物生产过程要求高：极易染菌、腐败，而失活，并产生热原或致敏物质，要求低温、无菌操作低温或冷冻保存、运输药物对酶敏感不易穿透胃肠粘膜，故多以注射途径给药需要有生物活性检验指标蛋白质类药物的结构蛋白质的基本结构单元是氨基酸。组成蛋白质的氨基酸有20多种氨基酸按排列顺序通过肽键相连接而成肽链，分子量较大，一般在5×103~5×106蛋白质氨基酸在肽链上的组成、序列、肽键数目、末端组成、二硫键的位置不同，决定蛋白质的生理功能蛋白质四级结构一级结构：由肽键连接起来的各种氨基酸的排列顺序二级结构：是指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式三级结构：是指已折叠的肽链分子中的空间构型四级结构：是指多亚基蛋白质中各个亚基的空间排布、亚基间的相互作用与其接触部位的布局蛋白质的一级结构初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键的位置氨基酸按排列顺序通过肽键相连接而成肽链蛋白质的二级结构二级结构指蛋白质多肽链骨架的折叠（folding）方式，即肽链主链有规律的空间排布α螺旋结构β折叠方式折叠中的主要作用力：⑴氢键⑵疏水作用力⑶离子键⑷范德华力蛋白质的三级结构三级结构是指已折叠的肽链分子中的空间构型，即分之中的三维结构或组合方式，系一条多肽链中所有原子的空间排布三级结构控制着蛋白质的生物功能疏水键、范德华力是稳定和维持蛋白质的三级结构的关键蛋白质的四级结构四级结构是指具有三级结构的蛋白质各亚基聚合而成的大分子蛋白质。四级结构可以两个以上的小亚基聚合而成。亚基是含有两条或多条多肽链的蛋白质，这些多肽链彼此以非共价键相联，每一条多肽链都有自己的三级结构。范德华力、离子键、配位键对维持蛋白质的四级结构是必不可少的蛋白质分子的构象与生物活性的关系又称空间结构、高级结构、立体结构等是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布。这种空间排布的变化仅涉及到氢键等次级键的生成和断裂，不涉及共价键的生成和断裂。蛋白质只有在立体结构是特定构象（conformation）时才有生物活性稳定蛋白质构象的作用力有疏水键、离子键、二硫键与配位键，除二硫键其余均为非共价键，说明维持蛋白质构象的作用力较弱，这些弱的作用力一旦被破坏，就会引起蛋白质构象的变化，由此伴随蛋白质生理活性的破坏。蛋白质的不稳定性化学不稳定主要指蛋白质分子通过共价键的形成和断裂形成了新的化学实体（Chemicalentity）物理不稳定指蛋白质分子的高级结构的物理转变，无共价键改变变性、聚集、沉淀、表面吸附蛋白质药物的不稳定性化学不稳定物理不稳定A水解去酰胺化分子内氨基分解肽基转移B氧化C外消旋Dβ-消除E二硫键的转变A变性B表面吸附C聚集D沉淀蛋白质的水解被酸、碱、蛋白酶催化水解蛋白质的水解反应可导致蛋白质或肽链的断裂，可降低或破坏其活性一般认为肽键是相对稳定反应热点部位:当肽链一级氨基酸序列中含有天冬酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp），谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu）时，相邻氨基酸是甘氨酸（Gly），丝氨酸（Ser），丙氨酸（Ala），脯氨酸（Pro）和苏氨酸（Thr）热点中有天冬酰胺和谷氨酰胺时，低pH可加速其降解的速度。有天冬氨酸和谷氨酸热点时，则高pH加速其降解蛋白质通常在极端条件下更易发生水解反应，如长时间至于极端的pH或高温下或蛋白质至于蛋白水解酶中蛋白水解酶对蛋白的水解作用不容忽视。细菌污染重组蛋白的纯化和分离中引入自动蛋白水解活性蛋白质的氧化很多肽和蛋白质易发生氧化降解反应，其中很多反应在大气氧中温和的条件下即可发生（自氧化）。影响氧化反应速率的因素有pH值、温度、金属离子、缓冲液等典型的氧化反应如硫醇基（甲硫氨酸、谷氨酸等）氧化成磺酸RSH→RSOH→RSSH→RSO2H→RSO3H含有组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和酪氨酸侧链的蛋白质易于发生氧化降解外消旋化旋光性物质在化学反应中，由于不对称碳原子上的基团在空间位置上发生了转移，使D-或L-氨基酸转变成D，L-混合物，旋光性消失的过程。蛋白质碱性水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用易于产生受蛋白水解酶破坏的肽键外消旋作用一般使氨基酸成为非代谢形式，可改变蛋白质的生物活性影响氨基酸消旋作用的因素有温度、pH、离子强度和金属离子螯合作用。二硫键断裂及其交换二硫键（—S—S—）是由两个半胱氨酸侧链上的巯基脱氢相连而成，是很强的化学键，二硫键的交换能导制不正确的配合，而导制活性快速丧失。二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质的三级结构，因此影响生物活性。H-S-R`R-S-S-RR-S-S-R`+H-S-R物理不稳定性蛋白质可经历各种无化学分子改变的结构变化，这是由于蛋白质具有聚合物的性质及它们选定高级结构的能力，如二级，三级和四级结构物理不稳定：蛋白质变性、聚集、沉淀和表面吸附原因：由于伸展、非天然的重新折叠、氢键的变化和疏水相互作用力的改变，使蛋白质的三维结构发生变化蛋白质变性是指天然分子球状折叠的改变，通常是二级结构的破坏变性是蛋白质物理结构的改变而不是它的化学组成的改变影响蛋白质变性的因素：温度pH值有机溶质的加入（如尿素、胍盐、乙酰胺、甲酰胺）有机溶剂（如乙醇、丙酮）表面吸附蛋白质表面吸附是指蛋白质粘附于与其接触的界面蛋白质在分离、纯化、制剂及生产过程中，与很多种表面相接触，如空气、玻璃、橡胶和其他合成材料，天然蛋白质的构象可能由于与这些表面发生相互作用而改变，这种相互作用也可使蛋白质吸附于这些表面上表面相互作用可导致构象的改变，外加作用力可加速这种构象的改变，这种作用的大小与可逆性与时间、温度、搅拌和表面的性质有关聚集蛋白质分子置于水溶液中，会自缔合形成二聚体、三聚体、六聚体以及大分子的聚集体自缔合与pH、溶剂组成，离子强度和溶剂的介电性有关。三级结构优先破坏，继而较稳定的二级结构也破坏宏观沉淀沉淀是宏观量的聚集，通常与变性共同发生胰岛素长期放于输液袋装置或剂型溶剂中时，可在装置或容器壁上沉淀容器内的空间可加速沉淀。这认为是胰岛素空气-水界面发生变性，继而加速沉淀影响胰岛素沉淀的因素有离子浓度、pH值、有无附加剂。胰岛素的释放系统经常由于蛋白质沉淀而阻塞，因此，要求经常清洗和灌流胰岛素与环糊精的复合物沉淀较少第二节蛋白质类药物制剂的处方与工艺（一）液体剂型中蛋白质类药物的稳定化（一）蛋白质类药物的一般处方组成（三）固体状态蛋白质类药物的稳定性与工艺一、蛋白质类药物的一般处方组成蛋白质药物因非注射途径给药存在生物利用度低等问题，目前多以注射途径给药。溶液型注射剂（2～8℃保存）冻干粉针注射剂二、液体剂型中蛋白质类药物的稳定化液体剂型蛋白质类药物的稳定化方法分两类：①改造其结构②加入适宜的辅料通过加入辅料，其稳定化的机理有两种a.加强蛋白质稳定作用力b.使其变性状态不稳定1．缓冲液pH值通常蛋白质的稳定pH范围很窄，准确控制制剂pH值是蛋白质稳定化的第一步毫无规律可寻现在常用的有磷酸盐、醋酸盐和枸橼酸盐缓冲盐，最常用的是磷酸盐2.糖和多元醇糖蔗糖和海藻糖最常用，避免选用还原糖，因其与氨基酸有相互作用的可能。多元醇常用的有甘油，甘露醇，山梨醇（浓度1~10%）糖和多元醇类的稳定作用与其使用浓度密切相关不同糖和多元醇的稳定作用取决于蛋白质的种类3．表面活性剂降低蛋白质溶液的表面张力，抑制蛋白质在疏水性表面的聚集、沉淀和吸附，或阻止蛋白质的化学降解。可供选择的表面活性剂有非离子型表面活性剂：聚山梨酯类、泊洛沙姆4.盐类盐的双重作用：稳定和破坏，还有可能毫无影响这主要取决于盐的种类、浓度、离子相互作用的性质及蛋白质的电荷低浓度的盐通过非特异性静电作用提高蛋白质的稳定性5．聚乙二醇类高浓度的PEG类，常作为蛋白质的低温保护剂和沉淀/结晶剂，它可与蛋白质的疏水链作用PEG类的稳定作用的机制仍不清楚6．大分子化合物很多大分子化合物已表明具有稳定蛋白质的作用其稳定机制可能是：空间隐蔽提高粘度人血清白蛋白（HAS）环糊精7．金属离子一些金属离子如钙、镁、锌与蛋白质结合，使整个蛋白质结构更加紧密、结实、稳定，从而使蛋白质稳定不同金属离子的稳定作用的浓度不同而且种类具有特异性。通过稳定实验选择金属离子稳定剂及其浓度8．氨基酸一些氨基酸单独或与其它辅料并用通过优先排除机制稳定蛋白质。如组氨酸、甘氨酸、天冬氨酸钠、谷氨酸及赖氨酸盐酸盐不同程度抑制45℃10mM磷酸钾缓冲液中rhKGF的聚集。某些氨基酸也可抑制蛋白质的化学降解，如甲硫氨酸是一种有效的抗氧剂。（三）固体状态蛋白质类药物的稳定性与工艺1.冷冻干燥蛋白质药物制剂2.喷雾干燥蛋白质制剂冷冻干燥蛋白质药物制剂选择适宜的辅料，提高蛋白质类药物在干燥状态下长期稳定性冷冻干燥工艺过程中参数的优化，如最低、最高干燥温度，干燥时间、真空度等冷冻干燥方法虽然可以改善蛋白质类药物制剂的稳定性。但如果没有适宜的辅料的蛋白质溶液进行冷冻干燥仍然能引起蛋白质不可逆的破坏。冷冻干燥过程中易失活的因素从液态到固态的相变过程中，蛋白质周围水分子被除去高浓度的盐和缓冲液组分的结晶缓冲液pKa对温度敏感而导致pH变化浓缩时蛋白质有限的溶解度制剂的冷冻温度饼状物融化或塌陷的温度产品降解温度冷冻干燥蛋白质制剂中典型的添加剂种类作用填充剂：甘露醇甘氨酸坍塌温度改善剂右旋糖酐白蛋白明胶冷冻保护剂：糖类白蛋白改善外观/防止组分损失提高坍塌温度保护蛋白质的物理结构喷雾干燥蛋白质制剂该方法制得的蛋白质干燥粉末已广泛用于吸入途径给药的蛋白质制剂中，在制备蛋白质类药物的控释制剂、开发新的给药系统，该方法极为有用加入稳定剂：蔗糖损失大、含水量高第三节蛋白质类药物新型给药系统一、新型注射（植入）给药系统控释微球制剂脉冲式给药系统（疫苗）二、非注射给药系统鼻腔给药系统口服途径给药直肠给药系统口腔黏膜给药系统（一）鼻腔给药系统非注射剂中较有希望的给药途径之一鼻腔黏膜中动静脉和毛细淋巴管分布十分丰富鼻腔呼吸区细胞表面具有大量微小绒毛各种酶类相对较少，对蛋白类的分解比胃肠道黏膜低有利于蛋白类药物的吸收并直接进入人体内血液循环（二）口服途径给药蛋白质类药物的口服给药存在以下限制①蛋白质类药物的胃肠道降解。胃酸、胃蛋白酶及肽酶的水解生成小肽，小肽进一步受肠酶水解②胃肠粘膜的穿透性差③形成多聚体④肝脏首过作用生物技术药物口服给药剂型微乳制剂纳米囊和纳米粒果胶钙胶囊生物黏附材料与肠溶材料