第7章 放射免疫技术

第七章放射免疫技术标记免疫技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。标记免疫分析：是利用多种标记技术与免疫技术相结合而建立的测定技术体系。其核心即是高灵敏性和高度特异性的有机结合。标记免疫技术－基本概念标记免疫技术免疫测定技术免疫组化技术示踪物及标记技术放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术化学发光技术金免疫技术⋯⋯⋯第一节放射免疫技术一、放射免疫技术－原理及分类放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。免疫放射分析(immunoradiometricassay,IRMA)以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。其他：放射受体分析(radioreceptorassay,RRA)放射配体结合分析(radioligandbindingassay,RBA)二、放射免疫技术－常用的放射性核素125I3H射线γβ理化性活泼差核素丰度90%－半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂常用标记核素125碘-标记物的制备－标记125I-化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原原子。125I或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应直接标记法三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少ch-T用量要低控制总反应体积200μl反应时间1-2分钟弱碱性反应条件间接标记法联接标记(bolton-Hunter)预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I化酯功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。bolton-Hunter125碘-标记物的制备－纯化凝胶过滤法离子交换层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳高效液相色谱法聚合、损伤物标记蛋白游离125I125碘-标记物的制备－鉴定标记物质量高比放射性高纯度完整免疫活性放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95%免疫活性标记物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应百分比该值越大,标记物免疫活性好比放射单位化学量标记物中所含的放射性强度单位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性过高，将影响标记物免疫活性计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.自身置换法：比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性结果准，测定复杂四、放射免疫技术－抗血清鉴定抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度用亲和常数Ka表示。单位为稀度单位（LM-1）Ka值高（109～12L/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准确度亲和性亲合力高亲合力低放射免疫技术－抗血清鉴定特异性:指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力交叉反应率：将反应的最大结合率抑制下降50%时特异性抗原与类似物的剂量（ED50）之比抗体交叉反应程度直接影响测定结果的准确性特异性效价反映抗血清中有效抗体含量的相对参数，即抗血清稀释至能与抗原发生有效反应的最大稀释度。效价:结合50%标记抗原时，抗血清的稀释度五、方法学评价除了常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性之外，应注意以下指标：可靠性：评价被测物与标准品的免疫活性是否相同的指标。剂量-反应曲线高剂量钩状效应：当标本中被测物的浓度超过线性范围上限时，所得结果反而降低或呈阴性的现象。第二节放射免疫分析一、放射免疫分析－基本原理竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力抗原－抗体反应须满足以下条件：1.Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质；2.所加入Ag*和Ab的量应是固定的；3.Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点；4.Ag*、Ag及Ab须处在同一反应体系中。B代表结合的标记抗原；F代表游离的标记抗原；T代表总的标记抗原。B/TF/T以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(B＋F)与Ag的量变存在着函数关系－剂量反应曲线注：T即是B与F的总和二、放射免疫分析－实验方法及测定抗原抗体反应Ag*Ag反应条件体积温度时间pHAb(标准Ag/样品Ag)平衡非平衡一步法二步法分离结合、游离标记物第二抗体沉淀法PEG沉淀法PR试剂法活性炭吸附法分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响操作应简单、重复性好经济测量、数据处理晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm)计算参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)拟合注：T即是B与F的总和第三节免疫放射分析一、免疫放射分析－基本原理以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。单位点IRMA先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合未结合标记抗体并将其分离,测定上清液的放射量双位点IRMA先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。二、IRMA与RIA比较RIAIRMA标记物抗原抗体原理竞争性结合非竞争结合反应体系Ag*、Ag、Ab固相Ab、Ab*、Ag反应动力学慢快灵敏度相对低高检测范围窄宽1~2数量级特异性差（PcAb）优（McAb）标准曲线结合率与测值成反比结合率与测值成正比待测抗原大小分子二抗原决定簇放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代。放射免疫分析技术的应用重点名词：标记免疫分析1.放射性标记物制备方法2.RIA和IRMA的原理及区别3.如何分离结合与游离标记物？1.放射免疫技术的核心是什么？2.制备放射性125I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？3.评价125I标记物质量的指标有哪些？4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？5.放免分析中标记/未标记抗原、抗体的用量特点及与免疫复合物的量变关系？6.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？7.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？8.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？9.γ闪烁计数器记录的信号即是放射核素的衰变吗？10.灵敏度、特异性和测定范围，免疫放射分析与放射免疫分析有何区别？思考题选择题放射免疫分析反应时，以下哪种情况是正确的（）A.Ag和Ag*具有等同的与Ab结合的能力B.Ag*为限量，且Ag的分子数多于Ag*，故竞争抑制Ag*与Ab的结合C.Ag*Ab复合物的形成与Ag的量成正比D.反应结束时，测定AgAb，即可确定待测抗原的含量E.Ag*不限量，且Ag的分子数多于Ag*，故竞争抑制Ag*与Ab的结合