4.免疫电镜细胞化学技术

免疫电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与功能的相互关系。免疫电镜技术免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，根据抗原抗体的高度特异性结合原理，用高电子密度的标记物（如：金、铁蛋白等）在超微结构水平上检测某些抗原性物质的定位、定性、半定量的一种方法。目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术，免疫铁蛋白技术和免疫胶体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗铁蛋白电镜复合物技术。用以标记抗体的酶要具备以下条件：1.与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。2.酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。3.在体液或组织中不存在该酶的底物。酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP）电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则1、取材与固定取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。（1）2%多聚甲醛液（2）2%多聚甲醛-0.01%～0.05%戊二醛（3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛2．通过冰冻切片或震动切片获得厚切片。冰冻切片8µm，震动切片20～80µm。3．漂洗后的厚切片可按免疫组化步骤进行标记染色。4．DAB显色后再进行锇酸后固定以及电镜包埋切片处理。5.如果确定待测抗原的抗原性不会由于脱水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色。三、免疫染色包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后再进行脱水包埋超薄切片。优点：（1）切片染色前未经四氧化锇固定、脱水、包埋等处理，对抗原性破坏较小。（2）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检出率.（3）免疫染色后，用四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保存。包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不需要穿透剂。2.免疫染色①直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。②间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。结果判定在已知阳性、阴性样品成立的前提下，出现高电子密度的颗粒，即指示抗原抗体的存在。（二）胶体金免疫电镜技术利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，使其与抗体相互吸引从而将抗体标记。再以金标记的抗体与待检抗原相互结合，由于金颗粒的电子密度高，电镜观察到金颗粒的位置，即抗原所在。2、胶体金的特性①颜色：胶体金的颜色与金粒子的直径有关，5-60nm时为红色，95nm是为蓝色，用于免疫细胞化学的胶体金呈红葡萄酒色。②影响胶体金稳定的因素：a.电解质：少量有促进稳定的作用，过量则破坏。b.胶体金的浓度：浓度越高容易导致胶体金凝集。c.温度：长时间加热可使稳定性有所下降。檬酸三钠的用量与胶体金直径的关系0.01%氯化金1%柠檬酸三钠胶体金颗粒直径（ml)（ml）（nm）1003.019.01004.015.01006.012.51001.524.51001.041.01000.671.5（1）胶体金的制备①柠檬酸三钠还原法（15nm）②鞣酸-柠檬酸钠还原法（6nm）鞣酸-柠檬酸钠还原法制备不同大小胶体金颗粒的配方1%柠檬酸三钠1%鞣酸0.025mol/LK2CO3去离子双蒸水胶体金颗粒直径（ml)（ml）（ml）（ml）（nm）40.02019.981540.1019.901040.50.515.006.043314.003.5优点：①胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显的变化。②金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒清晰可辨，易精确定位。③不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。④胶体金标记物易于制备，而且可以根据需要制备不同大小的胶体金，因此可以进行免疫电镜的双重标记。⑤根据抗原抗体反应部分结合金颗粒数量的多少，可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。（2）电镜包埋前免疫金染色①新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定0.5～1h），制成厚切片。②0.05mol/LTBSpH7.4漂洗3次，每次15min。③0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。④TBS漂洗，5min×3次，⑤1%牛血清孵育组织块30min。⑥第一抗体4℃孵育过夜后室温继续放置2h。⑦TBS漂洗，5min×3次，⑧室温下适当稀释度的胶体金标记探针（二抗胶体金探针或蛋白A胶体金探针等）孵育60min。⑨TBS漂洗，3min×3次，后再用双蒸水漂洗切片。⑩2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h，1%锇酸固定30～60min，常规脱水，包埋，切片染色后电镜观察。（3）电镜包埋后免疫金染色法①超薄切片50～70nm，置于镍网或金网中。②1%H2O2蚀刻，使试剂能穿透标本。EPON包埋的组织蚀刻时间约10min，而LRWhite、LRGold包埋的组织蚀刻时间则常小于5min.③双蒸水漂洗3次，每次10min。④1%牛血清孵育切片15min。⑤载网不冲洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室温孵育1～2h或4℃18～24h。⑥TBS漂洗，3min×3次。⑦室温下适当稀释度的胶体金标记探针（二抗胶体金探针或蛋白A胶体金探针等）孵育30～60min。⑧TBS漂洗，3min×3次，后在用双蒸水漂洗切片。⑨醋酸铀和硝酸铅轻微染色后电镜观察。2.电镜免疫金染色用于电镜的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根据抗原的性质加以选择。染色方法也有直接法和间接法。(5)染色结果判断假阳性染色和假阴性染色可以通过调整固定液种类、浓度、固定时间，改变一抗和二抗胶体金探针浓度、孵育时间、温度等减少假阳性和假阴性染色。双标记菌毛上两种抗原，胶体金5nm,20nm图7-11血小板表面胶体金标记GPIb单抗×9000铁蛋白标记电镜免疫细胞化学技术铁蛋白标记抗体是由Singer（1959）首创的一种免疫细胞化学技术。这技术曾广泛应用于病毒和细胞表面抗原的检测。铁蛋白作为电镜观察的标记物，具有颗粒大、分辨率高、散射力强的特点，可用于细胞膜表面抗原的准确定位。所以，虽然40年后的今天已发展了多种免疫电镜细胞化学技术，但铁蛋白标记法仍然是一种基本技术。基本原理：铁蛋白是一种直径10～12nm的球形的蛋白质（分子量450kD）,它含有致密的铁胶粒核心（直径约7.5nm），该核心含2000～5000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联剂形成抗体-铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核心，便于电镜观察。病毒免疫电镜技术5.影响因素：1）样品的纯度：负染色样品纯度要求不是很高，最好进行适当纯化；样品杂质太多，如大量的细胞碎片、培养基残渣、糖类、各种盐类结晶均会干扰染色效果及电镜观察。2）样品的浓度：被检查的样品要有适当的浓度。太浓太稀均影响电镜观察。3）样品与染液的均匀分散度为促进样品与染料的均匀分散提高染色效果，可以采用某些分散剂4）悬液与染液的酸碱度一般以中性或略偏酸性（PH6.4－7）为宜。5）染色时机的把握吸去过多样品悬液后尽快滴加负染色液1、标本－染液混合染色法：病毒悬液和2％的磷钨酸染液等量混合用毛细管滴到有膜的载网上（吸去过多的病毒－染液混合物），待干后进行电镜观察。一般认为病毒浓度在105以上时不难发现病毒。2、琼脂扩散技术：检测的材料中病毒含量不足时，为了达到浓缩病毒的目的，并去除材料中所含盐分，可采用琼脂扩散法。用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬液滴到琼脂块上，然后把载网倒悬在这滴悬液上。琼脂块把水分吸收，浓缩的病毒沾附在载网上，再经过负染色后进行电镜观察。3、假复型技术：琼脂或琼脂糖表面上粘附的病毒颗粒，以假复型的形式转移到火棉胶膜上或Formvar膜上。此种方法：能去除标本中的盐分、浓缩病毒；减少不必要的杂质；比较费时。方法：1）将20%的琼脂糖块放到载玻片上，滴上含病毒的悬液，将它放到紫外灯下照射消毒，直到悬液被琼脂吸干。2）在琼脂块的表面加一滴0.5%Formvar溶液，把多余的Formvar用滤纸片吸走。3）用刀片将琼脂块的边缘切除（为便于剥离）轻轻将载有琼脂块的载玻片浸入PTA或醋酸铀溶液中，并把Formvar膜剥离和漂浮到染液水面上。4）将铜网放到剥离到水面上的Formvar膜上。5）用不锈钢小柱把铜网膜同Formvar膜一起打捞出来，即可进行电镜观察。4、病毒颗粒免疫电镜技术：病毒颗粒与其外周相伴随的结构成分杂质或人工损伤产物混淆不清。特别是肠道病毒与粪便中成分难以分辨。这种情况需要借助特异性的抗血清（抗体），把病毒颗粒包被、凝聚起来。病毒颗粒经过特异性的抗体结合并凝聚成团之后，在负染色下显示出病毒结构，或包被在病毒颗粒表面的抗体，形成抗体桥，这种电镜技术称作免疫电镜技术。样品制备步骤：取0.9ml病毒悬液加0.1ml1：10稀释的恢复期病人血清充分混匀↓37℃1小时后，置4℃冰箱过夜↓然后用琼脂扩散法或假复型法制作电镜标本↓负染色后，电镜检查根据抗体凝聚的病毒颗粒的多少和程度以（+）表示。如果检查不到抗体包被的病毒颗粒，可离心，将沉淀重悬浮于1-2滴蒸馏水中，再用同样方法滴膜、负染。利用免疫电镜技术发现和鉴定了许多重要的病毒。