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胎儿染色体非整倍体无创基因检测(NIPT)——深圳市核子基因科技有限公司2背景知识1临床产前筛查与诊断方法2无创产前基因检测3主要内容简介具体操作流程43背景知识14名称病因发病率常染色体唐氏综合征21-3体1/600-800Edward综合征18-3体1/3500-8000Patau综合征13-3体1/7000-20000性染色体Turner综合征XO1/2500-5000(♀)克氏综合征XXY1/1000(♂)XXX综合征XXX1/1000(♀)常见染色体疾病5唐氏综合征(Down’ssyndrome)又称“21-三体综合征”或“先天愚型”，主要是由于细胞中多出一条21号染色体所导致的疾病。正常人核型唐氏综合征核型唐氏综合征概述6典型面容先天性智力低下、精神迟钝心脏、消化系统、五官的发育异常骨骼及肌肉发育不全，肌肉无力，身材矮小唐氏综合征临床表现7•多发畸形：容貌特殊，枕骨突出，95%以上伴有心脏畸形，胸骨过短，手指重叠、扭曲等；•发育障碍：新生儿常为过期生产，对声响反应微弱，骨骼和肌肉发育不良；•存活困难：一半以上胎死腹中，20%新生儿存活超过两个月，只有5-10%能够存活一年以上。7爱德华氏综合征（T18）临床特点8•严重畸形：患儿的畸形和临床表现要比21三体性严重得多，颅面、脑和内脏畸形非常普遍。前额、前脑发育缺陷，如无嗅脑，心室或心房间隔缺损，多囊肾等；•智力障碍：程度严重，存活较久的患儿还有癫痫样发作；•存活时间短：45%的患儿在出生后一个月内死亡，90%在6个月内死亡，存活至3岁者少于5%，平均寿命为130天。8帕陶氏综合征（T13）临床特点9•根据2004年我国卫生部妇幼保健与社区卫生司的调查结果，每一新发唐氏病例给家庭带来的直接经济负担是39.0万元。每年政府支出约80亿元用于患儿的医疗和社会救济。•给家庭带来巨大的心理压力和精神痛苦，多数患者容易受到歧视，特殊教育的接受水平普遍偏低，缺乏生活自理能力和社会适应能力，生存质量极差。9唐氏综合征（T21）对家庭和社会的危害10遗传因素：家族遗传生物因素：自身免疫疾病，病毒感染；物理因素：妊娠时放射线照射，放射性尘埃；化学因素：药物、农药、工业毒物、食品添加剂；随着孕妇年龄增加，唐氏综合征患病率显著升高；唐氏综合征发病机理唐氏综合征患病几率与人种、生活水准等没有直接联系，任何夫妻，各个年龄段的孕妇，均有怀唐氏儿的几率。11临床产前筛查与诊断方法212产前筛查：采用简便、可行、无创的检查方法，对发病率高、病情严重的遗传性疾病或先天畸形等在分娩前进行检查，检出子代具有出生缺陷高风险的人群。筛查出可疑者再进一步确诊，是防止出生缺陷的重要步骤。产前诊断：又称宫内诊断或出生前诊断，是通过直接或间接地方法对孕期胎儿性别及健康进行检测，防止具有严重遗传病、智力障碍及先天畸形的患儿出生。产前筛查&产前诊断的定义血清学筛查妊娠中期筛查AFP+hCG+E3AFP+hCGAFP+hCG+E3+inhibit妊娠早期筛查PAPP-Aβ-hCG超声筛查胎儿颈项透明层（NT）其他超声标志物13产前筛查:采用简便、可行、无创的检查方法，对发病率高、病情严重的遗传性疾病或先天畸形等在分娩前进行检查，检出子代具有出生缺陷高风险的人群。筛查出可疑者再进一步确诊，是防治出生缺陷的重要步骤。唐氏综合征产前筛查与诊断14胎儿颈项透明层（NT）NT15是指先天性疾病或遗传性疾病在胎儿期的诊断，是利用非侵入性或侵入性手段对胎儿进行的特异性检查，以便在早孕期或中孕期对异常胎儿作出诊断，及时治疗或处理。方法有创/无创孕周描述绒毛活检术有创10~131%~3%流产率99%检出率羊膜腔穿刺术有创16~210.5%~1%流产率99%检出率经腹脐静脉穿刺术有创20~280.5%~1%流产率99%检出率优点：核型分析可以作为产前诊断的金标准。缺点：损伤性；存在流产、宫内感染等风险,对医生的技术要求高，工作效率很难提高。产前诊断产前诊断方法16绒毛穿刺取样（chorionicvillussampling,CVS）羊水穿刺（amniocentesis）脐带穿刺（pencutaneousumbilicalbloodsampling,PUBS）绒毛活检术•10-13周•绒毛组织20mg（细胞培养或生化检查）•适用：高龄孕妇和高危孕妇孕早期诊断。•干扰：胎盘嵌合体•流产率1%-3%•其他风险：胎儿肢体发育缺陷等17羊膜腔穿刺术•16-21周•20mL羊水（细胞培养或其他检测）•适用：高龄孕妇和高危孕妇孕中期诊断•干扰：母血污染•流产风险0.5%-1%•其他风险：羊水泄露、母体血管损伤、宫内感染等18经腹脐静脉穿刺术•20-28周•脐血1-2ml，只需培养48h•适用:高龄孕妇和高危孕妇孕晚期诊断•干扰：母血污染•胎死宫内、早产率0.5%-1%•其他风险：穿刺失败、胎儿心动影响等1920在产前筛查和产前诊断之间缺少一个技术补充，它要具有产前诊断的高准确性，同时又具有安全、简便、无创的特点----基因水平方法侵入性孕周技术特点产前筛查孕妇外周血生化筛查非侵入性11-13+614-20+65%假阳性率，40%漏诊*超声颈部透明带非侵入性11-13+65-10%假阳性率，技术要求高产前诊断绒毛取样侵入性10-13+61-5%流产率羊水穿刺侵入性16-210.5-1%流产率脐静脉血穿刺侵入性20-281-2流产率产前筛查和诊断的方法对比21无创产前基因检测3一无创技术的理论基础与检测原理二技术开发进程与临床实践22理论基础—孕妇外周血中存在胎儿DNA23胎儿DNA的来源和特点来源：1胎儿细胞通过胎盘渗透到母血中，被母体免疫系统破坏，胎儿DNA残留下来；2胎儿细胞凋亡；3胎盘滋养层细胞的凋亡基本特点：1含量有一定的变化规律。妊娠第4周开始可检出胎儿游离DNA，随着孕周增加而增加，存在个体差异，平均浓度7.5%；2分娩后短时间内消失，平均半衰期为16.3min(4-30min)，2h就无法检出，前次妊娠情况不影响再次妊娠检测结果；3DNA片段较小，平均166bp左右。常规技术很难检测图1临床试验数据浓度随孕周变化趋势（内部数据）理论模型（基于测序的无创检测）母亲Chr21：95×2=190母体外周血中Chr21=190+10=200以21-三体为例：100DNA单位/毫升血浆。其中，95个单位来源于母亲，5个单位来源于胎儿通过大规模并行测序，获得分布在每条染色体上的真实的核酸片段数量，经过计数与比较：正常胎儿或者21-三体胎儿正常胎儿Chr21：5×2=10母亲Chr21：95×2=19021-三体胎儿Chr21：5×3=15母体外周血中Chr21=190+15=205国际应用进展（基于测序的无创DNA检测）•国际、国内同类型临床应用研究显示：基于测序的无创DNA检测技术，对于T21、T18、T13，均具有极高的检出率与准确性一无创技术的理论基础与检测原理二技术开发进程与临床实践3031检测技术概述•胎儿染色体非整倍体无创DNA检测（NIFTY）：通过采集5ml孕妇外周血，提取其中游离DNA并采用第二代高通量测序技术进行测序，通过生物信息分析，得出胎儿患“染色体非整倍体”的风险率。•技术定位：高精度产前筛查方法检测流程现场咨询与知情同意是血浆分离血浆游离DNA测序随访/常规诊断(绒毛膜穿刺、羊水穿刺等)32提取血浆DNA测序定位覆盖深度统计覆盖深度Cov-chrN=参考序列染色体N上有效测序片段总数样品染色体N上有效测序片段总数AACGT------CGATA-------TAGGC------ATCGC------生物信息比对Chr6Chr18ChrXChr21Chr7Chr13Chr11ChrY50bp统计值计算(t-值,L-值)确认胎儿是否为T21,T18,T13…测试样本ChrN的关联t-Score样本的覆盖深度—参考样本的修正覆盖深度参考样本的标准差L值=对数（样品正常可能性值）对数（样品患病可能性值）=技术流程正常21-三体34普通筛查胎儿患T21、T18或T13高风险的孕妇取外周血并编号用NIFTY来分析胎儿21号、18号和13号染色体羊水穿刺/核型分析双盲测试统计灵敏度和特异性结果分析临床研究（双盲)2020/1/30总数孕妇相关信息中位数(岁)33高龄孕妇(≥35岁)1217(35.1%)18–24岁(例,%)297(8.6%)25–29岁(例,%)1026(29.6%)30–34岁(例,%)804(23.2%)35–39岁(例,%)960(27.7%)≥40岁(例,%)257(7.4%)不详(例,%)120(3.5%)抽血孕周中位数(周)19范围(周)6-40≤12周(例,%)48(1.4%)13-16周(例,%)132(3.8%)17-20周(例,%)1677(48.4%)21-24周(例,%)1256(36.3%)25-28周(例,%)155(4.5%)≥29周(例,%)71(2.0%)不详(例,%)125(3.6%)B超发现染色体异常畸形(例)27(0.8%)唐筛信息已做–高风险(例,%)1365(39.4%)已做–低风险(例,%)232(6.7%)未做(例,%)1867(53.9%)临床研究（双盲)36检出高风险险样本数总例数T21T18T13样本总数（例）3000150519核型分析（例）3000149509假阳性（例）-110假阴性（例）-000检出率-100%100%100%假阳性率-0.035%0.034%0.00%阳性预测值-99.33%98.04%100%假阴性率-0%0%0%阴性预测值-100%100%100%临床研究（双盲)37具体操作流程4通过采集5ml孕妇外周血，提取其中游离DNA采用第二代高通量测序技术进行测序，通过生物信息分析，得出胎儿患“染色体非整倍体”的风险率。检测范围：可以用于检测21、18、13等染色体非整倍体。可作为一种产前筛查技术，极低的假阳性率大幅降低创伤性产前诊断比例，缓解临床压力。技术概述391、技术优势：无创：采集5ml孕妇外周血安全：避免胎儿宫内感染或流产早期：≥12孕周即可检测，最佳孕周（12-24周）准确：采用新一代测序技术，结合生物信息分析无创产前基因检测技术优势40所有孕周≥12周的孕妇；（最佳检测孕周：12-24周）适应群体年龄达35岁或以上的高龄孕妇拒绝做羊水穿刺者孕早、中期血清筛查21三体风险临界者（1/300-1/1000),孕早期超声提示胎儿异常有穿刺禁忌症孕妇(胎盘前置、流产征兆、感染乙肝、HIV、TP等)IVF、习惯性流产及其他原因“珍贵儿”错过有创产前诊断的孕妇检测对象：特别适合群体：41不能检测双胞胎及以上多胎；不适合检测染色体的微缺失、微重复以及结构异常（嵌合体型、易位型）;孕妇前期接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗等，而引入外源DNA，会影响检测结果;孕妇本人为“染色体非整倍体”患者，不适合进行该项检测；夫妇双方或一方为染色体结构异常者不适合进行该项检测；目前局限性样本采集、储存及运输2020/1/3042标本采集流程孕妇填写知情同意书、送检单并领取保险卡分离血浆孕妇抽血、贴条码(一一对应）寄送样本接收样本1、干冰寄送样本10公斤/2-3天、避免反复冻融2、每例样本对应4管血浆。孕妇必填基本信息并签名医生解答疑问1、采用5mLEDTA抗凝管2、条码分别贴送检单、知情同意书采血管、2.0mLEP管1、4℃8h内离心2、4℃1600g离心10min3、4℃16000g离心10min1、检查样品是否合格2、录入信息（SOP双人复核）缴费编号原则：PDB12+医院代码+5位流水号•全血样本量：5mL•采血管：专用采用管•样本标识：血液采集后，在样本采集管上标明孕妇姓名、年龄及孕周。•样本保存：常温下保存。•注意：送检过程中不能冰冻。样本采集2020/1/3044检测报告及解释2020/1/3045检测报告——正常报告结果解释1、低风险：说明胎儿患染色体非整倍体的风险很低，建议继