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第14章细胞分化的分子机制不同基因表达的调控是在以下几个水平完成的:不同基因的选择转录、RNA的选择加工和翻译水平的调控。一.发育中基因转录水平的调控1.珠蛋白基因的转录：利用珠蛋白mRNA反转录制备cDNA探针检测鸡胚红细胞中血红蛋白的合成。发现在孵化23小时鸡胚前部明区血岛中可见红细胞前体，但无珠蛋白基因的转录。经2次细胞分裂,在孵化35小时鸡胚中珠蛋白基因开始转录。成人的血红蛋白由4个珠蛋白亚单位(2个α-和2个β-)和4个血红素(亚铁原卟啉)分子组成(图)。在发育过程中血红蛋白中的珠蛋白亚单位发生变化：胚胎血红蛋白由2个ζ-珠蛋白链和2个ε-珠蛋白链组成;胎儿血红蛋白由2个α-珠蛋白链和2个γ-珠蛋白链组成;成人变为2个α-珠蛋白链和2个β-珠蛋白链，和少量α2δ2。(2个α-和2个β-)和4个血红素(亚铁原卟啉)分子组成。ζ=可塞γ=嘎吗ε=衣不C录在正常成人中α2β2占97%,α2δ2占2-3%，α2γ2占1%。人的ζ和α基因在16号染色体上，ε、γ、δ和β基因在11号染色体上分别依次排列，反映了血红蛋白从胚胎到胎儿再到成体转变中基因开关的顺序。在胚胎发育过程中，血红蛋白的构成发生系列变化的同时，红细胞产生也发生系列变化：在胚龄4-6周由卵黄囊产生，6周到出生由肝脏产生，18周至出生脾脏也能产生红细胞，18周直到成体均由骨髓产生（下图).以上尽管时间上有重叠，但它们产生红细胞的功能大小有差异。Percentageimportance:生理指数右图示在11号染色体上由左至右ε-、γ-、δ-和β-珠蛋白基因的排列顺序。在ε-珠蛋白基因上方6-22kb处有一个特殊的红色LCR(locuscontrolregion)区，此区含有4个DNA酶I敏感位点(箭头示)，第5个DNA酶I敏感位点位于β-珠蛋白基因下方(箭头示),此区的缺失导致γ-珠蛋白基因转录的永存，成为遗传性的胎儿血红蛋白永存(persistence)。ε-珠蛋白(胚胎的)基因下方是2个几乎相等的γ-珠蛋白(胎儿的)基因,它们后边是成体的δ-和β-珠蛋白基因。由Felsenfeld(1992)提出的关于LCR活动的模型.图2.DNA甲基化和基因活动人们经常设想一个基因含有完全相同的核苷酸而它是有活性的或无活性的。在1948年Hotchkiss在DNA中发现“第5个碱基”，5-甲基胞嘧啶。在真核细胞中，这个碱基是在DNA复制后被酶促形成的，在哺乳动物DNA中有5%的胞嘧啶被转变为5-甲基胞嘧啶。它只在胞嘧啶后边跟随一个鸟嘌呤(CpG)时产生。最近的研究显示基因中胞嘧啶甲基化程度控制DNA的转录。低甲基化有助基因活动，人胚胎红细胞珠蛋白基因活性与基因启动子甲基化的逆转相关(右上图)。胎儿的肝细胞在发育早期产生血红蛋白，其基因未甲基化，这些基因在成体组织中变为甲基化的。鸡的卵清蛋白基因在输卵管细胞中是未甲基化的，而在其它组织中这个基因是甲基化的。属器官特异甲基化的模式。correlatewith:把...与...联系起来Promoter:促进者3.哺乳动物X-染色体的剂量补偿(dosagecompensation)在动物中雌性每个细胞具有2个X-染色体,而雄性只有一个X-染色体。X-染色体上有数千个基因是细胞活动所必须的。在哺乳动物发现雌性细胞中只有一个X-染色体是有活性的，另一个转变为异染色质的，常常附着在雌性细胞核的核膜上，被称为巴氏小体。这样在雌雄细胞中都只有一个X-染色体具有活性，是相等的，称为剂量补偿。MarryLyon(1963)首先研究这一现象,并提出①在雌性哺乳动物发育早期2个X-染色体都有活性;②随发育每个细胞中1个X染色体失活;③失活是随机的,或父本的,或母本的;④此过程是不可逆的,一旦1个X-染色体失活,其后代都是失活的。这个假说提供了在转录水平不同基因失活的极好说明.Paternal：父亲的Maternal：母性的Galactosidase：牛乳糖二、通过RNA加工控制发育在细菌中不同基因的表达能在转录、翻译和蛋白质降解的水平调节。在真核细胞中存在另一种调节水平，即在RNA加工水平控制。1.不均一的核RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)实验证明mRNA并不是真核细胞的初级产物,存在一种核RNA(nuclearRNA,nRNA)，它比mRNA大得多，半衰期更短，大小变化广泛，称为不均一的核RNA。其分子具有大约5-19×103个核苷酸，mRNA只有2×103个核苷酸。海胆胚胎中mRNA的半衰期为5小时，而nRNA仅为20分钟。nRNA的复杂性比相同细胞mRNA大得多.2.nRNA加工控制早期发育染色体组转录出比mRNA多得多的序列。因此大量分化控制是在转录后特异的mRNA前体加工中。通过分离海胆囊胚的DNA，制备单拷贝DNA。实验发现囊胚细胞核的nRNA只结合15%单拷贝DNA，长腕幼虫的nRNA也结合15%的DNA.将以上两种nRNA混合后与DNA杂交，仍只与15%的DNA结合。结果表明囊胚和长腕幼虫的nRNA结合相同的DNA，二者是相等的。Hybridization：杂交Radioactive：放射性的Pluteus：长腕幼虫Blastula：囊胚Incubate：孵卵3.RNA加工控制发育的证据海胆mRNA的复杂性随着发育逐渐降低:卵母细胞的mRNA结合4.5%的DNA;囊胚的mRNA结合3.1%DNA;原肠胚mRNA结合2%DNA;组织分化细胞的mRNA只结合0.7%DNA。这种变化是否由于染色体组转录的变化？nRNA是否有类似的变化？通过分离囊胚的mRNA制备cDNA，它识别囊胚的mRNA。发现78%的cDNA结合囊胚的mRNA；而少于10%的cDNA结合成体肠的mRNA。此后用这种cDNA分别与原肠胚、肠和体腔细胞的nRNA杂交，结果发现大约80%的cDNA与三种细胞的nRNA结合。显然所有囊胚mRNA以nRNA的形式存在于所有肠、体腔和原肠胚细胞的核中。即使已分化的细胞的核都在转录囊胚特异的序列。显然海胆基因表达的控制主要发生在RNA加工的水平。三、发育过程的翻译和翻译后调节在信使被转录、加工和运出细胞核后，它仍许翻译形成基因编码的蛋白质。在翻译和翻译后水平仍存在对基因表达的调控。1.真核细胞翻译的机制通过翻译包含在mRNA核苷酸序列的信息指导一种特定多肽的合成。翻译大致分为三个阶段：起始(initiation)、延长(elongation)和终止(termination;下图)，它们分别被起始因子、延长因子和终止因子的可溶性蛋白质调节。起始阶段包括起始因子tRNAi与40S核糖体和mRNA结合形成起始复合体，tRNA到核糖体和在氨基酸之间形成肽链，并放弃它们的tRNA携带者。由于氨基酸连在一起，核糖体沿信使向下移动，暴露新的密码以便tRNA结合。终止发生在核糖体遇到mRNA的UAG,UAA和UGA密码时。它们不被tRNA识别，也不编码蛋白质.2.协调蛋白质合成的翻译控制:血红蛋白的产生血红蛋白是由染色体组不同区域协调产生的，它必须保证α-珠蛋白链、β-珠蛋白链和血红素分子呈2:2:4的比率。合适的比率是由血红素调节的:①过量的血红素将关掉它自己的合成;②过量的血红素刺激珠蛋白的产生:当缺少血红素时特异的蛋白激酶磷酸化起始因子，翻译终止;过多的血红素结合蛋白激酶，使之失活,翻译继续进行,从而调节珠蛋白合成。另外，每个二倍体细胞中有4个活性α-珠蛋白基因和只2个β-珠蛋白基因。如果每个基因以相同的速度被转录和翻译，那么α-珠蛋白比β-珠蛋白分子多一倍.但结果是α:β-珠蛋白mRNA为1.4:1;而蛋白质比为1:1。因此蛋白质的相等说明包含了翻译的调节。因为β-珠蛋白信使可更好地竞争翻译起始因子，5’帽状序列的次级结构影响翻译的效率。Eukaryotic：真核的Reticulocyte：网状细胞Inclusion：包含,内含物Dramatic：戏剧性的,生动的3.基因表达的翻译后调节⑴通过翻译后机制激活蛋白质：许多新合成的多肽是没有活性的，必须经过修饰才行，肽激素就是如此。如胰岛素前体是一个带有3个二硫键的长肽(下图)，此前体必须在中间和开头处断开，两个剩余的片断被二硫键连在一起才有活性。基因表达的翻译后(posttranslation)调控证据：①蛋白质合成后不修饰没有活性;②有的蛋白质合成后被选择地失活;③蛋白质必须“标明地址”以便到达靶区；④蛋白质组装成大的功能结构。哺乳动物的原-ACTH内啡肽是由几个小的肽激素形成的一个长的前体，它断开形成促肾上腺皮质激素、γ-促脂解激素和β-内啡肽。它们进一步加工依赖细胞所处的特异环境。在垂体前叶ACTHA是一个终产物,它分泌后刺激肾上腺皮质产生甾类激素；在垂体的中间叶细胞中，ACTH被断开形成α-促黑素细胞激素。⑵不同蛋白质的失活有些蛋白质在细胞内保存是危险的。那些与细胞分裂时间选择相关的蛋白质在DNA合成与细胞生长协调时必须迅速降解。已证明这些迅速被降解的蛋白质(半衰期小于2小时)具有1个或多个区域富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸。长寿命的蛋白质很少这样的基团，如果有也被深深埋在蛋白质的构型中。β-半乳糖苷酶通过改变其第一个密码(AUG)为其它15个氨基酸密码时，其稳定性大大改变：半衰期由20小时以上(丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸等）到最少2分钟(精氨酸)不等(下左图).在活体内当细胞死亡时蛋白质的氨基酸末端也被翻译后的修饰，一些不稳定的氨基酸(精氨酸、赖氨酸和酪氨酸）从氨酰化的tRNA转移到这些氨基酸的氨基末端。乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸和乳酸可逆地相互转化。LDH被两个基因编码(LDH-A,LDH-B)的四聚体，可能有5种形式的组合:4A(1):3A1B(4):2A2B(6):1A3B(4):4B(1)。一种酶可被选择的形式称为同功酶(isozymes)。但在不同的器官中同功酶的比率变化很大：肌肉LDH主要由A亚单位形成，而精巢、心脏和肾脏同功酶主要由B亚单位形成。LDH-A合成在组织间没有大不同，它降解的速率存在巨大不同(右下图左至右:胃、肾脏、舌、肌肉、肺、脑和心脏；上为B-亚单位、下为A-亚单位)⑶翻译后修饰蛋白质的亚细胞定位蛋白质合成后必须合适的定位：一种蛋白质可能同时定位于可溶性蛋白质中、线粒体中、内质网中或细胞核中；甚至从细胞中分泌出去。那些预定成为溶酶体、内质网或分泌的蛋白质被送入粗面内质网的腔中,此时它们仍然被翻译着(右下图)。这样的蛋白质含有一个大约30-50个氨基酸的信号序列(signalsequence)，它被一个悬浮于细胞质中的信号受体复合物识别。这个复合物结合于细胞质正在形成肽的核糖体时，翻译停止。而当这个复合物结合于内质网上的对接蛋白(dockingprotein)时，翻译又恢复。生长中的多肽可穿过内质网的膜，一旦进入腔内信号序列就被除去，保留的蛋白质被修饰。如果此蛋白质含有一个疏水区，它可能变为内质网部分，此后变为细胞膜。一些特殊的氨基酸序列决定它定位的细胞膜特定区域。内质网中一些肽可共价地结合6-磷酸甘露糖而修饰蛋白质，此糖起地址标记的作用，它被内质网特殊区域的受体识别和结合，结合后此处向外突出形成溶酶体。当不被识别和结合时，蛋白质就从细胞中分泌出去。Carbohydrate：碳水化合物⑷超分子的装配(Supramolecularassembly)翻译后调节的另外一种形式涉及新合成的蛋白质装配成一个功能单位。例如血红蛋白和乳酸脱氢酶二者都含有4个多肽链，它们共价键地连接形成有功能的蛋白质。稍高水平肌动蛋白由球状的单体聚合成微丝，它是受精时顶体突起的伸展必须的；微管蛋白装配成有丝分裂器的微管，随着有丝分裂的完成它们又变为单体。此后它们又被装配成微管，它在稳定细胞形状上至关重要。⑸胶原蛋白(collagen)：翻译后调控的概括胶原蛋白的合成证实翻译后调控的重要性和多样性。①胶原蛋白mRNA被翻译成原胶原肽，其氨基末端含一个信号序列引导它进入内质网腔，信号序列断开，单个原胶原蛋白分子遇到3个羟基化酶，其中2个将脯