22局部用药的毒性研究

第二十二章局部用药的毒性研究案例★痤疮是一种毛囊皮脂炎症，多发于青年男女面部、胸部等皮脂分泌旺盛的区域，持续时间长，且易反复发作。◆克林霉素-过氧苯甲酰凝胶是由克林霉素磷酸脂与过氧苯甲酰制成的复方制剂，临床用于痤疮治疗。要求观察其对皮肤的刺激性与过敏反应。局部用药的毒性试验是根据局部用药部位的解剖和生理特点设计的。涂剂、擦剂皮肤用药膏剂、凝胶剂其他透皮吸收制剂常用局部用药制剂滴眼剂、滴鼻剂喷雾剂直肠和阴道制剂肌内注射第一节皮肤用药的毒性研究皮肤组织结构表皮真皮皮下组织皮肤覆盖全身。表皮较薄，厚为0.1-0.2mm。角质层表皮颗粒层生发层真皮依附于皮下组织，厚约2mm。胶原真皮弹性硬蛋白纤维母细胞一、化学物质对皮肤毒性作用的类型根据性质不同，由药物引起的皮肤损害包括原发性刺激炎症反应和致敏反应，偶然也可引起皮肤癌。（一）皮肤原发性刺激原发性刺激—药物直接作用于皮肤引起的病理性反应。红斑、水肿原发性刺激的表现水疱疮溃疡强碱脂溶性溶剂原发性刺激机理镉酸盐银、汞、砷等金属盐特征：有明确的毒理学量-效关系。首次接触即可产生某种特征。（二）皮肤致敏皮肤致敏为变态反应，包括：药物致敏和光敏反应。作用机制药物与蛋白以共价键结合，具用免疫原性。药物在光的作用下，形成半抗原性物质。特征没有明确的毒理学量-效关系。再次接触该药物才能激发特定症状。（三）皮肤致癌有机大分子化合物----多环芳烃类金属盐----无机砷盐（一）皮肤用药急性毒性实验1.定义：指动物完整或破损皮肤一次性接触受试物后在短期内出现的毒性反应实验。2.受试物：使用临床制剂，如临床制剂浓度无法满足剂量要求，受试物为粉末状的用适宜基质（如凡士林、羊毛脂等）溶解混匀。3.实验动物及实验条件每组动物数：一般选白色家兔、小型猪4-6只，大鼠或豚鼠10只，雌雄各半；动物体重：家兔2-3kg，豚鼠200-300g，大鼠200-250g，小型猪30-40kg。饮食、摄水：自由饮食、摄水。动物房温湿度：家兔、豚鼠及小型猪控制在18-26℃；大鼠控制在20-25℃，相对湿度均为40%-70%；换气次数为10-20次/min；12h明暗交替光照。4.剂量设计至少应设三个剂量组，另设赋形剂对照组，必要时设空白对照组。如受试物在拟用临床给药时有可能与破损皮肤接触，则应另设破损皮肤组。5.实验操作给药前24h对给药区（通常在背部）进行脱毛处理，给药时将受试物均匀涂于动物脱毛区，液体制剂，应将受试物涂于敷料上，再贴于脱毛或破损皮肤区，用半封闭的外罩固定敷料。涂敷24h后，除去敷料，用温水或适宜的溶剂除去残留的受试物和赋形剂。观察期：连续观察14d，观察1-2次/天。也可根据出现毒性反应的情况适当延长。观察指标：给药前后7d、14d称体重，观察给药后动物的全身反应：皮毛、眼睛、黏膜、呼吸、行为、自主活动、肌张力等，有无颤抖、震颤、抽搐、流涎、腹泻、少动、精神萎靡不振、昏迷等毒性反应症状。若有动物死亡应立即进行尸检，有明显异常时，应进一步进行病理组织学检查。6.观察指标7.结果评价对观察到的阳性症状结合大体解剖或病理组织学结果进行综合分析，与对照组比较，对动物的毒性反应及死亡原因作出明确判断。病理组对照组（二）皮肤给药长期毒性实验1.定义指动物完整或破损皮肤长期反复接触受试物后出现的毒性反应及其可逆程度实验。2.受试物与“皮肤给药急性毒性试验”基本相同。3.实验动物及条件与“皮肤给药急性毒性试验”一致。4.剂量设计至少应设三个剂量组.(可设赋形剂对照组，必要时设空白对照组。)高剂量：原则上应使动物产生明显的毒性反应，甚至出现个别动物死亡；低剂量：原则上应高于动物药效学实验的等效剂量，并不使动物出现毒性反应；中剂量：动物可出现轻度毒性反应。5.给药期限药物临床疗程皮肤给药长期毒性实验给药期限可以支持的临床研究阶段单次给药2周Ⅱ期，Ⅲ期（及生产）≤2周1个月Ⅱ期，Ⅲ期（及生产）2周~1个月1个月Ⅱ期3个月Ⅲ期（及生产）≤3个月3个月Ⅱ期6个月Ⅲ期（及生产）≤6个月6个月Ⅱ期，Ⅲ期（及生产）6个月6个月Ⅱ期，Ⅲ期（及生产）6.给药频率★给药期限3个月，原则上应每天给药；★给药期限≥3个月，每周至少应给药6d；★也可根据临床给药频率给药。7.恢复期限给药结束后保留部分动物，继续观察其可能出现的延迟性毒性反应，并了解毒性反应的可逆程度。根据受试物的药代动力学特点、靶器官或靶组织的毒性反应和实际恢复情况确定恢复期的长短。8.实验操作首次给药前24h对给药区在背部进行脱毛处理。每天给药1次，每次至少接触6h。保证受试物与给药部位具有良好接触并避免动物食入药物。可用纱布等无刺激性辅料包裹或给动物穿上特制的通透性好的外套。9.观察指标除增加给药部位皮肤及其周围组织乃至全身皮肤变化和皮肤病理学检查外，其余指标与长期毒性实验要求一样。10.结果评价局部毒性反应的结果评价与长毒实验要求一样，应根据各检测指标及病理组织学检查结果综合分析。除此以外还应注意评价给药局部及其周围组织的毒性反应。（三）皮肤刺激性实验1.定义：皮肤刺激性：指经皮肤给药后，在皮肤上产生的可逆性炎性病变。（若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。）皮肤刺激性实验：是观察动物的皮肤接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出等局部反应。2.受试物应采用与临床应用制剂一致，符合临床用质量标准规定的受试物进行实验，同时注明其名称、来源、批号、含量（或规格）、赋形剂、保存条件及配制方法等，其中赋形剂和杂质等的名称和量应尽可能明确，并附有研制单位的自检报告。所用赋形剂应该标明批号、规格和生产厂家，并符合实验要求。3.实验动物多种哺乳动物可以选择，一般首选白色家兔，每组动物数4～8只，雌、雄各半。也可以选用其他种属的动物(如小型猪等),选择家兔和小型猪以外的动物应阐明合理性。4.实验操作设赋形剂对照，采用同体左右侧自身对比法。试验前24h对给药区进行脱毛处理。去毛范围各3cm×3cm。(给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不宜进行实验。)进行破损皮肤的刺激性研究时，在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。4.实验操作受试物药量一般是固体或半固体0.5g，液体0.5ml，直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用两层纱布(2.5cm×2.5cm)和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋形剂做对照。贴敷时间至少4h。贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位。注：多次给药皮肤刺激性实验应连续在同一部位给药，每次给药时间相同，贴敷期限一般不超过4周。刺激反应分值刺激反应分值红斑无红斑0轻度红斑（勉强可见）1中度红斑（明显可见）2重度红斑3紫红色红斑到轻度焦痂形成4水肿无水肿0轻度水肿（勉强可见）1中度水肿（明显隆起）2重度水肿（皮肤隆起1mm，轮廓清楚）3严重水肿（皮肤隆起1mm以上并有扩大）4总分值85.观察指标在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。按表给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。6.结果评价单次给药实验：计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值，按表进行刺激强度评价。多次给药实验：首先计算每一观察时间点各组积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物积分均值，按表进行刺激强度评价。分值评价分值评价0~0.49无刺激性0.5~2.99轻度刺激性3.0~5.99中度刺激性6.0~8.0强刺激性（四）皮肤吸收试验（1）整体皮肤吸收试验化合物经皮渗透的量同皮肤微灌流量直接相关，通过测量与皮肤灌流量相关的电压，测算出化学经皮吸收速率。1）LDV法用643.8nm氦-氖激光，照射血管中流动中的红细胞，测量用药前后变化，测定出皮肤吸收速度。PPG法LED射出的800-940nm红外线照射，收集反射光转变成电压波谱，通过电压波谱变化，计算皮肤吸收量的大小。（2）离体皮肤吸收试验静态渗透装置上室防药剂，下室接受液，下室中间方皮肤并密封，药剂放于皮肤之上，每隔一定时间后，测定接受液，计算皮肤渗透率。流动渗透装置上述方法的改进，接受液为血浆或白蛋白，以5ml/小时的速度灌流，测定不同时间灌流液的药量。以次测定皮肤的透过率。（五）皮肤过敏试验目的通过动物皮肤重复接触受试物，观察机体免疫系统反映在皮肤上的表现。方法实验材料1）动物-豚鼠2）受试药物-膏剂、液体不稀释直接涂敷3）阳性致敏物：2,4-二硝基氯代苯1%-致敏浓度0.1%-激发浓度试验方法1）试验分组随机分成三组：给药组、赋形剂组、阳性对照组2）致敏接触0.1-0.2ml(g)涂于脱毛区，接触6小时，第7天和14天亦同样方法重复。3）激发接触末次给药后第14天，激发给药，6、24、48和72小时观察皮肤过敏情况。结果判断与评价皮肤过敏反应评分标准刺激反应程度分值刺激反应程度分值红斑形成水肿形成无红斑0无水肿0轻度红斑1轻度水肿1中度红斑2中度水肿2重度红斑3重度水肿3水肿性红斑4最高总分值7致敏率分类过敏反应强度致敏率%弱致敏性0-10轻度致敏性10-30中度致敏性30-60高度致敏性60-80极度致敏性80-100红斑形成总分+水肿形成总分反应平均值=合计动物总数（六）皮肤光敏试验目的观察受试物接触皮肤后遇光照否有光敏反应试验方法1）光敏反应试验评价标准2）光毒性试验评价标准第二节眼睛用药刺激性试验眼睛的结构角膜结膜炎炎症角膜表面水肿上皮脱落刺激作用结膜充血、水肿灼痛、流泪、畏光慢性结膜炎、睑腺炎、分泌物增多试验目的角膜浑浊刺激性试验试验方法虹膜结果与评价结膜水肿分泌物目的观察动物眼睛接触受试物所产生的刺激反应方法家兔，原液（原膏）加入眼睛肿0.1ml(0.1g)，闭合5-10分钟。6、24、48和72小时至7天眼刺激情况。结果与评价眼刺激反应评分眼刺激反应分值角膜浑浊0-4虹膜0-2结膜0-3水肿0-4分泌物0-3总分16眼刺激性评价标准刺激程度积分无刺激性0-3轻度刺激性4-8中度刺激性9-12重度刺激性13-16第三节肌内注射用药局部刺激性试验目的肌内注射后药物对肌肉的刺激性反应情况。方法家兔6只，一侧骨四头肌注射供试物，另一侧注射生理盐水1-2ml作为对照，48小时处死动物，取骨四头肌纵向剖开，肉眼观察，观察注射部位刺激情况，必要时作组织病理学检查。家兔股四头肌肌肉组织结果与评价肌内注射刺激反应评分标准反应级数刺激反应0给药部位无明显反应1给药部位轻度充血，直径0.5cm以下2给药部位中度充血，直径1.0cm以下3给药部位中度充血，红肿，肌肉有变性4出现肌肉褐色变性，坏死0.5cm以下5肌肉严重变性，出现大片坏死超过2认为不符合规定，不可进行肌内注射第四节静脉给药局部刺激性试验见第二十章：全身用药毒性试验中-血管刺激性试验第五节滴鼻剂和吸入剂的毒性试验一、滴鼻剂和吸入剂急性毒性试验目的观察受试物一次滴入或吸入后对动物产生的毒性反应或死亡情况。方法3个剂量组，组距0.65-0.85,滴入或吸入；4小时后即可以及7-14天观察动物。结果评价二、滴鼻剂和吸入剂刺激性试验目的观察受试物一次滴入或吸入后对动物产生的刺激反应。方法将受试物滴入或喷雾于动物，24小时后处死动物，观察有无充血、红肿等。结果评价第六节应用于直肠、阴道制剂的毒性试验一、直肠、阴道用药急性毒性试验目的受试物对动物直肠或阴道产生的毒性反应或死亡情况。方法栓剂、膏剂或液体等，将受试物轻置入直肠或阴道内。至少接触4小时，观察即可以及7-14天的情况。结果评价二、直肠、阴道用药长期毒性试验目的方法结果评价三、直肠、阴道用药刺激性试验目的方法结果评价四、有关问题1、给药量与给药浓度2、给药途径3、多次给药问题4、对照组的建立1.实验动物的选择依据拟采用的实验模型和观察指标选择实验动物，一般每个实验选择一种动物进行评价。2.给药的频率与期限给药的频率与期限应依据拟定临床应用的情况来决定。重复给药的制剂，一般每天给药一次，给药期限最长不超过4周。单次给药的制剂可用单次给药的方法进行实验。3.可逆性观察为明确毒性反应的性