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中国农业大学学报!!#!$%&#$=&’==)*+,-./*0123-.45,36+/7+,./8-39:,;37&B种中草药对奶牛隐性乳房炎病原菌体外抗菌作用的研究刘澜$!周德刚!!莫云$!黄建茹$!葛冰$!臧丽&!丛日刚$$F北京大北农集团动物保健技术研究中心!北京$$%B%!F北京市兽药监察所!北京$$B%&F北京市延庆县畜牧兽医总站!北京$!$#摘!要!研究!(味中草药对隐性乳房炎分离得金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抗菌效果!杯碟法试验表明%黄连黄芩紫花地丁板蓝根等对!种病原菌的综合抑菌效果较好%达到中敏或高敏%有的甚至是极敏%抑菌圈直径为$#e#!%e#&DD!微量稀释法试验表明%黄连黄芩红花金银花板蓝根等对!种病原菌的综合效果好%LE1为e%#e(&5(DT%LJ1为e%#e(&5(DT!本试验可为研究外用治疗奶牛乳房炎中草药制剂的开发提供科学依据!关键词!中草药#隐性乳房炎#奶牛#病原菌#抗菌试验中图分类号!Q=A=F!&!!!文章编号!$B’%&&&!##&’=&’(!!!文献标志码!4收稿日期$!=’$!’!!基金项目$北京市海淀区科技项目\!=$#B#第一作者$刘澜!博士后!高级兽医师!主要从事动物药品研究!C’D.3/$D;/3+7*-5!93YF;3-.F6*D通讯作者$周德刚!高级兽医师!主要从事动物药品研究!C’D.3/$Va;a6;!.2**F6*DF6-4,#10%#)$0/)@@)%#*&@EZH-,)*)-)$10/N)(%,)*&,.0#-&;),*&@(0$+%&#-*81%/,%0/N0*##*%18%2’B3CB0,D!IJ5CT)7;0,;E!L598,D!JC4!:K0,7$8D!:MY,;D!I4!:BU!H5!:7;0,;D9[N7Z+(&,0%316E’16$/D’./(6(54M’#’1+./*’$’+!7’%8%59:9V:J!*/%1%F[7’%8%5!#$%$&$’()S’$’+%1+4N+&5*($+(6!7’%8%59::9:J!*/%1%U[_1a%50%316E&#B12+412S’$’+%1+4-$1$%(!7’%8%59:F9::!*/%1#41*#$0%#!D/’%?%$+(1$%B%($%.$’#$#()FW*/%’#’/’+B163’2%.%’#!#&./1#M/%Q(31.(,$%2%#!M12%=#.&$’661+%1’!E’+B1$1+1=1.%12E’+B1?%(61’!’$.@C’+’.(2&.$’2($/’%#(61$’2-$1,/46(.(..&+’L#./’+%./%1.(6%)+(3$/’21%+4.(CC%$/#&B.6%%.1631#$%$%#B4.46%2’+,61$’123%.+(2%6&$%(3’$/(2#@D/’+’#&6$()$/’,61$’3’$/(2$’#$%2%.1$’2$/1$$/’M/%Q(31.(,$%2%#!M12%=#.&$’661+%1’!E’+B1?%(61’!M12%=%#1$%2%#’$.@C’+’3(+’’))’.$%?’.(3,1+’2C%$/($/’+*/%’#’/’+B163’2%.%’#($/’-@1&+’L@.(6%!12$/’%+#’#%$%?%$4$($/’F,1$/(5’#1+’3(2’+1$’(+/%5/64!(+’=$+’3’64/%5/!$/’+15’()1$%B1.$’+%162%13’$’+#C1#9]@::bFV@]U33@D/’+’#&6$()$/’3%.+(2%6&$%(3’$/(2$’#$16#(#/(C’2$/1$$/’M/%Q(31.(,$%2%#!M12%=#.&$’661+%1’!X6(#.1+$/13%!X6(#6(%.’+1’!M12%=%#1$%2%#!’$.@C’+’3(+’’))’.$%?’.(3,1+’2C%$/($/’+*/%’#’/’+B163’2%.%’#($/’-@1&+’L@.(6%!$/’%+A!*C1#:@::Vb:@:WU5*3P!12$/’%+A7*C1#:@::Vb:@:WU5*3P+’#,’.$%?’64@D/%##$&24,+(?%2’#1#.%’$%)%.B1#%#)(+$/’2’?’6(,3’$()$+12%$%(16*/%’#’3’2%.%’#($/’’=$’+16$+’1$3’$#()$/’31#$%$%#%21%+4.(C@=)+&$(*!*/%’#’/’+B163’2%.%’#%#&B.6%%.1631#$%$%#%21%+4.(C%,1$/(5’#%1$%B1.$’+%16$’#$!!奶牛乳房炎是一种常见的&复杂的&造成奶牛业经济损失最严重的疾病’据报道!国外奶牛乳房炎发病率约为!Ac#(c($)!我国达!c#Bc!个别牛群发病率更高(!)’乳房炎造成牛奶质量低劣!产奶量下降!治疗费用不断增高’此外!乳房炎也造成诸多奶牛被过早淘汰!给养殖业造成巨大损失’目前全世界约有!e!亿头奶牛!其中约有$*&的奶牛患有各种类型的乳房炎(&)!特别是隐性乳房炎居多!约占乳房炎总数的#Bc’我国牛隐性乳房炎发病率高达A%e$c(%)!北京地区隐性乳房炎发病率为中国农业大学学报!#年第$%卷!%Be!c(A)!全世界每年因乳房炎造成的经济损失高达&A亿美元(()’西方一些国家对此病已经进行了$多年的研究!我国于!世纪=年代初也开始对该病进行研究!虽然在研究中取得了显著的成绩!但是还未达到彻底解决的目标’因此!国内外学者仍在对该病进行大量的&深入的研究’在治疗奶牛乳房炎的过程中!抗生素及化学药物应用最多(B)!虽然二者在治疗奶牛乳房炎及其他细菌感染疾病上起到了巨大作用!但是长期大量使用这些药物!产生了诸多问题例如细菌耐药性严重!治疗效果越来越差!畜禽机体免疫力下降!乳制品安全问题和环境污染等’因此!人们开始关注天然药物&免疫调节剂等绿色环保型产品的研究开发!以无残留速效中草药(=)替代抗生素’研究发现许多中草药不仅具有体&内外良好的抗菌消炎作用!而且能够提高奶牛整体免疫机能(#’$$)!因此开发中草药制剂治疗乳房炎具有实际应用价值’目前!中草药方剂对奶牛隐性乳房炎起到了良好的治疗作用!但大多为验方!剂型也主要是粗制型的散剂和煎剂!缺乏注射液&灌注剂等高科技含量的剂型($!)’为此!本研究旨在从!(种具有清热解毒&抗菌消炎作用的中草药中筛选具有较强体外抑菌作用的单味中草药’!!材料与方法!F!!材料!F!F!!药材根据中草药药性选取清热解毒&抗菌消炎&活血化瘀作用显著的黄连&黄芩&瓜蒌&丹参&鱼腥草&马齿苋&红花&蛇床子&何首乌&川芎&白芷&大黄&板蓝根&黄芪&王不留行&赤芍&大青叶&黄柏&金银花&蒲公英&紫花地丁&连翘&当归&白芍&漏芦&夏枯草共!(味中草药!均购自北京市怀柔区华峰药店!并依照!A年.中国兽药典/!版#的方法进行鉴定!符合生药质量标准’!F!F&!试验菌株选取临床患隐性乳房炎奶牛病例分离的经检测证明致病性较强的!种病原菌$金黄色葡萄球菌.+’#9@(04044&’:8&和大肠杆菌C&498:$49$’40($!由本实验室分离&提纯&鉴定后保存’!F!F’!仪器与试剂微量移液器%QS_型超净工作台%INM’&(型电热恒温培养箱%_‘’!=J型高压灭菌锅%4T1$$%型电子天平’LN琼脂培养基和LN肉汤培养基购自中国药品生物制品检定所#!普通营养琼脂培养基和肉汤培养基北京双旋微生物培养基制品厂#!氯化钠分析纯!南京化学试剂厂#’!F&!方法!F&F!!试验药液的制备采用水提法($&)$称取一定量的单味中草药!加$倍量蒸馏水加热回流提取!次!每次$2!合并滤液并离心分离!减压浓缩至$DT液体相当于原生药$e5以下试验中换算成质量浓度!5*DT#!$h煮沸灭菌!%h保存备用’!F&F&!试验菌液制备将临床分离的金黄色葡萄球菌&大肠杆菌先接种于平板!于&Bh培养$=2后!挑选典型菌落接种于ADT肉汤中!于&Bh培养$=2后!eA麦氏单位标准比浊管比浊!用肉汤将菌液稀释至$A60+*DT!备用’!F&F’!杯碟法抑菌试验采用杯碟法($%)’将牛津杯等距离均匀地放置在已铺好菌层的平皿上!每个平皿放置%个杯!&个试验杯!每个试验杯中加入F!DT中草药提取液!$个对照杯加入等体积灭菌生理盐水!&Bh培养箱中培养!%2!测量抑菌圈直径’每种药物设!个平行试验组!结果取平均值’抑菌效果判定标准$抑菌圈直径(!DD为极敏!$A#$#DD为高敏!$#$%DD为中敏!%/DD为低敏($A)’!F&F(!最小抑菌浓度&LE1’的测定采用微量稀释法($%)’经消毒的#(孔板每排$#$各孔中!用微量移液器依次加入用肉汤倍比稀释的药液!每孔!’T!共$个不同的浓度!然后在每孔中加入稀释菌液$’T!第$$&$!孔分别为阴性对照组不加入病原细菌#和阳性对照组不加药物#’置于振荡器上振荡$D3-!使孔内溶液充分混匀后!微孔板加盖并用胶纸密封后放在铺有湿纱布的方形搪瓷盘中!于&Bh温箱中孵育$=2!用眼观察无菌生长孔所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度LE1’!F&FA!最小杀菌浓度&LJ1’的测定分别吸取F$DT上述药物最小抑菌浓度以上未见细菌生长的各孔培养物!移至不含药的平皿琼脂培养基上!用无菌T推棒轻轻推开培养物!置&Bh培养箱中培养过夜!观察有无菌生长!计数少%=!第&期刘澜等$!(种中草药对奶牛隐性乳房炎病原菌体外抗菌作用的研究于A个菌落者即为该药的最小杀菌浓度LJ1’&!结果与分析&F!!杯碟法试验结果杯碟法试验结果表明同一中草药对!个菌株抑菌效果有很大差异表$#’!(种中草药对金黄色葡萄球菌的抑菌效果为$黄连&紫花地丁&当归&红花&板蓝根极敏!效果最好的为黄连%黄芩&黄芪高敏%蒲公英&蛇床子&白芷&丹参&连翘&黄柏&大黄&川芎中敏%漏芦等其他$$味药为低敏或无抑菌作用’!(种中草药对大肠杆菌的抑菌效果为$黄连高敏!紫花地丁&瓜蒌&板蓝根&黄芩&白芍中敏%蒲公英&大青叶&蛇床子&黄柏&金银花低敏%其余$A味药无抑菌作用’不难发现$黄连&黄芩&紫花地丁&板蓝根等清热解毒类中草药的综合抑菌效果较好!而活血化瘀类中草药如当归&红花&白芷&丹参等对金黄色葡萄球菌的抑菌作用很好!但对大肠杆菌没有抑制作用’表!!&B种中草药对&种病原菌的体外抗菌效果W.V/:$!4-73V.67:,3./:00:67;*0!(123-:;:2:,V./D:X363-:;.5.3-;7!Y.72*5:-36D36,**,5.-3;D;$%$+:0抑菌圈直径*DD!!中草药名称金黄色葡萄球菌.+’#9@(04044&’:8&大肠杆菌C640($黄连P23b*D.6*Y73X3;!%F#&fFB#$AF!f$F$当归P.X3Z.-5:/36.:;3-:-;3;!&F(%f$F![紫花地丁N:,V.93*/.:!FB(f$FA!$!FAf$F!$红花R/*;6.,72.D3!FAfF!=[板蓝根P.X3Z3;.73X3;!F&(f!F&&$$Ff$F$B黄芩P.X3Z;6+7://.,3.:$#FfF%!$FAfF((黄芪P.X3Z.;7,.5./3$BF%f$FA[蛇床子R,+67+;6-3X33$&F=%fF$!=FAf$F&%白芷P.X3Z.-5:/36.:X.2+,36.:$&F(%fF=![丹参P.X3Z;./93.:D3/73*,,23b.:$&F!=f$FA![大黄P.X3Z:7,23b*D.,2:3$&Ff$F![黄柏1*,7:ZY2://*X:-X,3$&FfF=#=Ff$F川芎P23b*D.62+.-Z3*-5$!F%#fF#$[蒲公英N:,V.7.,.Z.63$$F$=f$F$&#F=(fF&&连翘R,+67+;0*,;723.:$F%f$F(=[大青叶R*/3+D3;.73X3;#FA%fFA(=Ff$FA瓜蒌R,+67+;7,362*;.-723;=F=fF&&$&FfF=#金银花R