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如何养好细胞——污染的防治状态好的细胞是做好一切实验的基石•好的细胞状态是好的结果重复性的保证污染——细胞培养的大敌影响细胞状态影响细胞的生长与细胞竞争营养最终导致细胞死亡对于新手，细胞污染几乎是无法避免的问题！什么是细胞污染？•凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染•细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性细胞污染的分类–物理污染–化学污染–生物污染物理污染•危害•引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡污染来源预防方法孵箱放在温度较恒定的房间中培养液从冰箱取出后在室温放置放射线试剂周围不能放同位素振动孵箱周围不能放引起振动的设备辐射试剂不要放在带有玻璃门的冰箱中温度化学污染•危害•化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。污染来源预防方法传统用双蒸和三蒸水现在用纯水仪millipore新购买的血清用之前要试应选用同一批次的血清选用纯度最高的试剂经过权威机构认定正确的配制和储存方法（ＳＯＰ）培养用器皿储存不同物质时应选用合适的塑料或玻璃容器使用纯度高的CO2，分析级：纯度99.9%打扫培箱时，避免消毒剂和清洗剂的残留水血清培养液及试剂孵箱金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染。超纯水放置过久其纯度会下降血清又是潜在的生物及化学污染的来源/血清采集于多个动物，而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同，因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异培养液、培养附加成分、试剂培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，培养器皿的大小，构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的pH值和细胞生长密度。培养器皿的工艺及灭菌过程中的差异可能对培养体系产生影响。生物污染来源•1环境：细胞房以及内部设施；培养箱；超净工作台；保存细胞的液氮•2操作者本身•3操作器械•4血清•5培养液及的试剂•6运输生物污染的种类：•1细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌），真菌（霉菌、白色念珠菌、酵母），黑焦虫•2支原体、病毒•3其他细胞交叉污染细菌污染——293细胞50X100X细菌污染——293细胞200X细菌污染——293细胞，正常霉菌污染——sk-hep-1细胞50X100X霉菌污染——sk-hep-1细胞，正常50X100X支原体污染——MHCC-LM6细胞50X100X支原体污染——MHCC-LM6细胞，正常50X100X支原体污染——T-47D细胞200X400X支原体污染——T-47D细胞，正常100X其他污染——MEF细胞100X，污染100X，正常细胞交叉污染•Celllinecross-contamination：20世纪60年代被发现•细胞污染和细菌污染不同，细胞污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染没有微生物存在，但使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性，形态发生变化。•有些变化轻微，不易察觉，有些则可能由于污染的细胞具有生长优势而最终压过原来细胞而导致细胞生长的抑制，最终死亡。•污染过的细胞由于种类不纯，无法进行实验研究。•据估计，15%-20%的时间里，实验中所使用的细胞已经不是原来的细胞系，或者与其他细胞系发生了交叉污染。•鉴定方法：短串联重复序列（STR）分析的DNA指纹图谱•CrossContaminationsv6_8-March9,2012如何判断污染？•第一类污染，较易判断，肉眼即可观察。污染物与细胞在同一平面；•细菌污染：培液易浑浊，低倍镜下即可见大量类似浮游生物的小黑点在做自主运动，高倍镜下观察，可见细菌形态：大肠杆菌为杆状，像双截棍；金黄色葡萄球菌为球状；•真菌污染：短期内培养液多不变混浊培，但是有漂浮物，或者在皿底看到众多克隆状物体，倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝，并漂浮在培养液中念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长；•有时通过显微镜可能会发现在培养瓶外壁生长的菌丝，较易误认为污染。发现瓶外的菌丝后应及时用酒精擦拭干净。如何判断污染？•第二类污染：需要借助试剂盒，经验丰富者也可判断•支原体：PCR法（假阴性）•HoechstDNA染色（假阳性）•病毒：较隐蔽，荧光显微镜•第三类污染：最难发现，当发现细胞生长特性和形态突然发生变化，而细胞又没有其它污染时，要考虑该污染；•关键：在于经验，平时养细胞时多留意细胞状态，在细胞状态好、代数低的时候一定要拍照存档，以此作为参考衡量细胞状态。对于新接手的细胞一定要清楚它正常的形态的时候的样子。这样，能在第一时间发现细胞异常并及时处理。•与培养体系中的异物区分开：棉絮，塑料渣，外来颗粒，血清中变性的蛋白质等，细胞碎片•有些异物会作布朗运动，需要与细菌等的自主运动区分开•主要特点：易增殖，与细胞夺取营养。轻者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞浆中出现较多的颗粒物质；较重的细胞增殖停止，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。••传说中的黑胶虫？•这是什么污染？•在高倍镜下（400X）观察有很多会动的小微生物，但是培养基不变浑浊，也不影响细胞生长，低倍镜下看不到该小微生物•如何处理污染？•最好的方法：•避免污染！•关键：•环境、操作无菌意识和责任心•养细胞就像养宠物，得顺着它的脾气，你对它好，它自然也对你好•依照它的性子，跟着细胞走如何避免•建做好种子库：储存库（液氮）和工作库（-80℃）•在细胞代数较低，状态较好时保种•对于需要保种的细胞，一定要单独操作！•良好的规章制度：各自的试剂单独分装使用，不随便乱用别人的试剂；•良好的工作习惯：保持细胞房环境的清洁：房间每天照紫外，一周打扫一次•保持操作环境的清洁：•做实验前先检查台子上的物品是否齐全，避免频繁走动导致的污染•保持开阔的操作野，枪头，EP管架等合理放置；•动作迅速利落，减少细胞暴露在外的次数（超净台≠没有菌）•废液最好用负压吸引器吸入废液缸•使用台子超过两个小时，需要紫外灭菌•配试剂，一定要在台子充分灭菌，没有做过其他实验的情况下配；培养基的倾倒也是如此•做过病毒的台子不能用来处理空细胞•分装试剂不能太满，以防冻存体积膨胀导致污染•合理使用抗生素！•防止细胞中的菌产生耐药性，发生隐性污染。一旦出现污染，难以救治。•对于支原体污染，血清是个重要的污染源，可以采取56℃灭活的方法，可以去除大部分的支原体•在使用一瓶新的培液前，一定要做好菌培，实在没有时间，可以用肉眼先观察培液的浑浊度，或者用空皿盛装一定的培液镜下观察细胞污染•——拯救•如果遇到污染，细胞又十分珍贵，如何拯救？•首先隔离已经污染的细胞，该细胞的培养试剂单独分装使用，•操作了污染的细胞的台子，不可在短时间内再操作其他细胞；•原则：稀释，稀释，再稀释！•抗生素杀•100X的PS双抗可以杀灭绝大多数的细菌：高浓度的PS冲击治疗，反复冲洗，最后逐渐降低浓度——拯救过一株细胞，最后撤离了PS，冻存后复苏细胞背景也很干净，状态也不错，不过很费时费力。而且对细胞是否有影响，未知；•对付支原体污染，交叉使用两种不同谱的抗生素，灭杀效果更明显•试剂污染的处理：0.2um的滤器过滤