第6章 电泳法技术

第六章电泳技术2基本要求1概述2基本原理聚丙烯酰胺凝胶电泳内容提要SDS电泳等电聚焦电泳63453基本要求一、掌握电泳的基本原理；二、掌握聚丙烯酰胺电泳和SDS电泳的原理及方法；三、熟悉等电聚焦电泳的原理。4电泳——带电粒子或离子在电场作用下的定向移动，依据带电粒子在电场作用下迁移行为不同进行分离的技术称为电泳(electrophoresis)。概述51808年俄国物理学家Peнce首先发现了电泳现象。当时多用于胶体化学的分析。1937年Tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳，以界面折光率差别分离蛋白，即界面电泳。1948年Wieland等发明以滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化。近30年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置不断改进，出现了许多新型的电泳技术。发展简史6(一)分类1、按其原理不同可分为：(1)移动界面电泳(2)区带电泳(3)等速电泳(4)等电聚焦电泳7AB+BABAABBAABCCBA移界区带ABC等速等电聚焦pH9876混合分离稳态时毗邻稳态时分离静止82、按其支持物的物理性状不同可分为：(1)滤纸及其它纤维电泳：如玻璃纤维膜、醋酸纤维膜、聚胺纤维薄膜。(2)凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。(3)粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。(4)线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。(一)分类93、按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：(1)平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式。(2)垂直板式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。(3)垂直柱式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。(一)分类104、按pH的连续性不同，区带电泳可分为：(1)连续pH电泳：整个电泳过程pH保持不变，如纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳等。(2)非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳和等电聚焦电泳等。(一)分类111、分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2、分析某种物质的纯度及分子量3、电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析4、免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力(二)应用12(一)电泳的基本原理在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘积。F=QX质点前行受到的阻力f为：f=6πγην（γ为质点半径，η为介质粘滞系数，ν为质点移动速度）当F=f时，QX=6πγην(1)第一节基本原理ν=QX/6πγη13ν/X为带电分子在单位电场强度下的运动速度。———迁移率、电泳速度（μ）在具体实验中：ν=d/t电场强度：X=E/lμ=X6πγηνQ=(2)μ=νd/tdlXE/lEt==(一)电泳的基本原理14某物质A在电场中移动的距离：dA=μA·Et/l某物质B在电场中移动的距离：dB=μB·Et/l两物质移动距离差为：∆d=(dA-dB)=(μA-μB)Et/l(3)若μA=μB则∆d=0两者不能分离若μA≠μB则∆d≠0两者能分离(一)电泳的基本原理151、待分离物质的性质：分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。(二)影响电泳的因素2、溶液性质（1）pH值溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。对蛋白质两性电解质而言，pH值离pI越远，则颗粒净电荷越多，泳动速度越快，反之则越慢。16（2）离子强度离子强度影响颗粒的电动电势。溶液的离子强度越高，电动电势越小，则电泳速度越慢；反之则越快。一般最适的离子强度在0.02～0.2之间。I=1/2ΣCiZi2(I=离子强度，Ci=离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数)离子强度过低，溶液的缓冲能力减弱，不易维持所需pH值，反而会影响颗粒带电荷状态影响电泳。（3）粘度迁移率与溶液粘度成反比。(二)影响电泳的因素173、电场强度：电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。电场强度对电泳速度起着决定性作用，电场强度越高，电泳速度越快；但随着电压的增加，电流加大，产生热效应，易使蛋白质变性而改变性质影响电泳。进行高压电泳应配备冷却水系统以便在电泳过程中降温。(二)影响电泳的因素184、电渗现象液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。(二)影响电泳的因素19＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋+-液相固相电渗流(EOF)电渗流示意图205、焦耳热电流越大，产热越多，会使区带扩散，影响分辨率。溶液离子强度越高，电流强度也越高，则产热越多。6、筛孔筛孔越大，泳动速度越快。21第二节聚丙烯酰胺凝胶电泳一、原理以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。【优点】设备简单、操作方便样本量少（1-100μg）时间短可分离物质的大小范围广、分辨率高22连续系统凝胶层的不连续性不连续系统缓冲液离子成分的不连续性电位梯度的不连续性pH的不连续性一、原理23一、原理1、浓缩效应（1）凝胶层的不连续性浓缩胶：大孔、光聚合分离胶：小孔、化学聚合（2）缓冲液离子成分的不连续性凝胶：快离子（先行离子）Cl-缓冲液：慢离子（随后离子）H2CH2COO-24一、原理25一、原理（3）电位梯度的不连续性电泳速度=电位梯度×迁移率低电导区，高电位梯度26一、原理27一、原理（4）pH的不连续性慢离子在浓缩胶中迁移率较所有被分离样品的有效迁移率低，使样品夹在快慢离子界面间；在分离胶中，慢离子的迁移率高于所有被分离样品。282、分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。3、电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。一、原理29二、凝胶性能及制备1、性能机械强度好、有弹性、透明、对pH和温度变化稳定、没有吸附和电渗作用。2、制备丙烯酰胺（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成。（1）化学聚合催化剂：过硫酸铵(AP)加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）30二、凝胶性能及制备（2）光聚合催化剂：核黄素(VitB2)【优点】VitB2用量低（1mg/100ml）可以预定聚合时间【缺点】凝胶孔径较大，不太稳定。31二、凝胶性能及制备3、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-105×1052-5核酸(RNA)10415–20104–1055-10105-2×1062-2.632三、蛋白质染色1、氨基黑10Bλmax=620-630nm，酸性染料。其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料之一，但对SDS-蛋白质染色效果不好。另外，氨基黑10B染不同蛋白质时，着色度不等、色调不一(有蓝、黑、棕等)；作同一凝胶柱的扫描时，误差较大。33三、蛋白质染色2、考马斯亮蓝R250λmax=560-590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。该染料是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超过一定范围时，对高浓度蛋白质染色不合乎Beer定律，作定量分析时要注意这点。34三、蛋白质染色3、考马斯亮蓝G250G250比R250多二个甲基。λmax=590-610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。其优点是在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地使蛋白质染色而几乎无本底色，所以常用于重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。35三、蛋白质染色5、银染法较R250灵敏高100倍，适于微量样品分析。但染色机制尚不清楚，可能与摄影过程Ag+的还原相似。其灵敏度很高，牛血清为4×10-5μg/mm2，即清蛋白为8×10-5μg/mm2，cytC为1.7×10-4μg/mm2，因此也常用于凝胶电泳蛋白质染色。36四、装置37五、操作过程1.VerticalSlabGelUnit2.Insertingthespacer3.Attachingtheclamp4.Assemblingthegelcastingstrand38五、操作过程5.Mixingthegelundervacuum6.Polymerizedresolvingwithwateroverlay7.Insertingcombinto‘stackinggel’8.Removingcombfrom‘stackinggel’39五、操作过程