第6章 目的基因克隆

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第一节PCR扩增法获得目的基因第六章目的基因克隆本节要点RT-PCR法RT-PCR的步骤三种不同引物引导的RT-PCR已知基因N端部分序列RT-PCR其它PCR法反向PCR锚定PCR连接介导的PCR盒式PCRRACE第一节PCR扩增法获得目的基因一、RT-PCR法第一节PCR扩增法获得目的基因1.RT-PCR的步骤反转录PCR扩增获得RNA模板反转录:将RNA反转录成cDNA第一链常用RNA模板常采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法提取的总RNA中只有少部分是mRNA,大部分为rRNA和tRNA第一节PCR扩增法获得目的基因TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂,含有苯酚、异硫氰酸胍等物质.细胞总RNA采用亲和层析法第一节PCR扩增法获得目的基因oligo(dT)纤维素柱分离纯化真核mRNAmRNA基因特异引物(genespecificprimer,GSP)多聚寡核苷酸引物(oligo(dT)primer)随机六核苷酸引物(randomhexamerprimer)第一节PCR扩增法获得目的基因三种引物扩增特异性高低反转录将RNA反转录成cDNA第一链反转录的引物:三种以合成的cDNA单链为模板,采用基因特异引物进行常规PCR扩增过程:第一节PCR扩增法获得目的基因PCR扩增上游引物与cDNA第一链退火,在DNA聚合酶的作用下合成cDNA第二链以cDNA第一链和第二链为模板,用上、下游引物进行PCR扩增2.三种不同引物引导的RT-PCR第一节PCR扩增法获得目的基因RNA提取反转录第一节PCR扩增法获得目的基因PCR过程3.已知基因N端部分序列RT-PCR目的基因的DNA序列未知,但其编码蛋白的N端部分氨基酸序列已知根据氨基酸序列设计的简并引物和oligo(dT)进行RT-PCR第一节PCR扩增法获得目的基因简并引物根据密码子的简并性设计的针对编码每个氨基酸的所有碱基组合的混合物扩增对象扩增方法第一节PCR扩增法获得目的基因已知基因N端部分序列RT-PCR示意图获得的目的基因的DNA片段不完整,仅知道基因上一小段序列信息时第一节PCR扩增法获得目的基因二、其他PCR法反向PCR锚定PCR连接介导的PCR盒式PCRRACE适用对象方法用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段1.反向PCR第一节PCR扩增法获得目的基因扩增对象操作过程酶切连接环化PCR扩增测序分析第一节PCR扩增法获得目的基因反向PCR原理示意图RS:限制性内切酶酶切位点GSP:基因特异引物1.锚定PCR根据已知序列设计的基因特异引物2.锚定PCR第一节PCR扩增法获得目的基因扩增对象也称之为单侧特异引物PCR(SSP-PCR),是根据已知目的基因的一小段序列信息来快速扩增已知序列上游或下游片段的技术引物引物1引物2即锚定引物,根据序列的共同特征设计的非特异性引物,非特异性引物所起的作用是在其中一端附着。与锚定引物结合的序列称为锚定序列。第一节PCR扩增法获得目的基因方法扩增目的基因已知序列下游3’端未知序列oligo(dT)作为锚定引物扩增目的基因已知序列上游5’端未知序列用DNA末端转移酶,在cDNA3’末端加上Poly(dA)尾与此Poly(dA)相对应的Poly(dT)作为锚定引物第一节PCR扩增法获得目的基因PCR具体过程包括两轮PCR扩增第一轮:采用不对称PCR高浓度的基因特异引物和低浓度的非特异性引物第二轮:以稀释后的第一轮PCR产物作为模板相同浓度的基因特异引物和非特异性引物进行扩增第一节PCR扩增法获得目的基因锚定PCR原理示意图在普通PCR过程中增加了连接的步骤,即通过连接反应加上去一个公共接头3.连接介导的PCR第一节PCR扩增法获得目的基因应用范围只知道DNA一端的序列又要对未知的一端进行测序对体内甲基化图谱或DNA印迹进行分析方法引物第一节PCR扩增法获得目的基因通过目的基因的已知序列设计的基因特异引物引物1引物2接头引物第一节PCR扩增法获得目的基因连接介导的PCR原理示意图4.盒式PCR方法在普通PCR过程中加入了一个Cassette(盒)人工合成的带有限制性内切酶的粘性末端的双链DNA分子第一节PCR扩增法获得目的基因Cassette在设计时其5′末端没有磷酸基团目的DNA片段的3′末端和Cassette的5′末端的连接部位形成缺口在第一次PCR的第一个循环,从Cassette引物CP1开始的延伸反应在连接部位终止,限制了引物CP1和引物CP1同一引物之间的扩增,减少了非特异性PCR扩增特点第一节PCR扩增法获得目的基因第一节PCR扩增法获得目的基因盒式PCR原理示意图CP:Cassette引物GSP:基因特异引物(正义引物)AGSP:基因特异引物(反义引物)5’端之间的未知序列5’RACE5.RACErapid-amplificationofcDNAends第一节PCR扩增法获得目的基因通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增,得到基因转录本的未知序列,从而获得mRNA完整序列的方法过程和分类以mRNA为模板反转录成cDNA第一链用PCR扩增出cDNA内某一已知序列位点到其3’端之间的未知序列3’RACE锚定PCR被用于RACE技术,根据锚定序列引入方式的不同,RACE分为经典RACE和新RACE第一节PCR扩增法获得目的基因经典RACE:以锚定序列作为引物,3’RACE中在反转录时引入第一链cDNA,5’RACE中在合成第二链时引入第二链cDNA新RACE:锚定序列在反转录以前以寡聚核苷酸RNA的形式连入mRNA中经典3’RACE操作步骤第一节PCR扩增法获得目的基因以mRNA为模板,用反转录引物合成3’端cDNA第一链,在5’端引入了OP和IP序列以基因特异引物GSP1和外侧引物OP进行第一轮PCR扩增以第一轮PCR扩增的产物为模板,以基因特异引物GSP2和内侧引物IP进行第二轮PCR扩增PCR产物进行直接测序或克隆于适当载体进行序列分析即锚定引物TTT(T)n-IP-OP,含oligo(dT)序列、外侧引物区OP和内侧引物区IP第一节PCR扩增法获得目的基因经典3’RACE原理示意图TTT(T)n-IP-OP:锚定引物IP:内侧引物区OP:外侧引物区GSP:基因特异引物经典5’RACE操作步骤第一节PCR扩增法获得目的基因以基因特异引物GSP1作为反转录引物产生cDNA第一链在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下,在cDNA3’末端加上Poly(dC)(或Poly(dA))尾利用锚定引物(5’OP-IP-oligo(dG))(或5’OP-IP-oligo(dT))和基因特异引物GSP1进行第一轮PCR扩增以第一轮PCR反应的产物为模板,以基因特异引物GSP2和内侧引物IP进行第二轮PCR扩增第一节PCR扩增法获得目的基因经典5’RACE原理示意图新型5’RACE操作步骤CIAP处理总RNA,使rRNA、tRNA或5’端不完整无帽的mRNA去磷酸化脱掉5’磷酸基团TAP处理全长的mRNA,去掉其帽子结构,保留5’端的一个磷酸基团设计锚定序列,具OP和IP区,用T4RNA连接酶,将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸与去掉帽子结构的mRNA进行连接设计两条引物GSP1和GSP2,GSP1在GSP2的外侧,以第三步中形成的杂合体为模板,利用引物GSP1为反转录引物合成cDNA第一链第一节PCR扩增法获得目的基因用GSP1和OP,GSP2和IP进行巢式PCR第一节PCR扩增法获得目的基因新型5’RACE原理示意图CIAP:牛小肠碱性磷酸酶TAP:烟草酸性焦磷酸酶OP:外侧引物区IP:内测引物区GSP:基因特异引物第二节基因的合成随着技术的发展,用化学的方法人工合成基因成为可能,人工合成的基因可以是生物体内已经存在的,也可以是按照人们的愿望和特殊需要重新设计的。1970年,美国麻省理工学院Khorana等人首次报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸的全人工合成基因H.G.Khorana(1922-)一、DNA人工合成的原理利用人为操纵的化学反应,使核苷酸间形成正确联接发展历史:H-亚磷酸酯→磷酸二酯法→磷酸三酯法→亚磷酸三酯法固相亚磷酸三酯法:目前最通用的一种合成寡核苷酸的方法,是在偶联于固相支持物上的连接臂末端通过逐个加上核苷酸来实现的,其一个合成循环周期分为四个步骤——去保护(deprotection)、偶联(coupling)、封端(capping)、氧化(oxidation)二、人工合成基因基因的人工合成是在寡核苷酸化学合成的基础上建立的,通常的策略是将需要合成的基因分成若干个相互重叠的片段,先利用化学合成法分别合成这些小片段,然后让这些片段退火配对,最后利用连接酶和聚合酶将这些片段连接成完整的基因序列。DNA小片段→全长基因1、退火-连接法2、多步退火-延伸-连接法3、由内向外多步退火-延伸合成法第三节基因组DNA的克隆基因组文库构建●概述►定义:某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中,这个群体就称为该生物基因组的文库(genomiclibrary)►目的:a)分离有用的目的基因(可培养细菌+未可培养细菌)b)保存某种生物的全部基因(可培养细菌)●一般流程●一般流程●高分子量环境样品DNA的准备对象细胞收集细胞裂解、内切酶消化脉冲场凝胶电泳细胞的低熔点Agarose凝胶包埋(琼脂糖栓Agaroseplug)大片断DNA的回收与浓缩(100kb)PFGE分离大片断DNA分子脉冲场凝胶电泳DNA分子在凝胶中的运动●载体的选择和制备载体选择载体宿主容载(kb)稳定性嵌合性DNA制备植物转化能力λ噬菌体E.coli9-24+—易—Cosmid粘粒E.coli33-47+—易—YAC载体酵母100-1000—+难—P1载体E.coli75-100+—易—BAC载体E.coli50-350+—易—PAC载体E.coli100-300+—易—TAC载体E.coli70-200+—易+BAC(Bacteialartificialchromosome)vector细菌人工染色体载体结构BAC载体特点对插入大片断的外源DNA(300kb)能够复制严谨、稳定通过电激发转化大肠杆菌的效率较高已超螺旋状态存在,分离抽提比YAC容易克隆中几乎不存在嵌合体(Chimrism)●连接克隆片段的大小与构建文库克隆子的关系ln(1-p)文库实际克隆数(N)=ln(1-f)其中p为期望的可能性,f为DNA片段平均长度与基因组DNA总长的比值大片段DNA是否能有效连接在载体上主要取决于插入DNA片段与载体的比例,对于不同生物采用的比例不同,大多数BAC文库采用1∶5-15(摩尔比)目标DNA和载体浓度的确定●转化制备用于电转化的感受态大肠杆菌细胞电激转化对于转化大肠杆菌而言,电转化是目前使用最普通的一种手段。电转化效率与插入片段的大小有关,插入片段越大,转化效率越低;反之,越高。此外,转化条件(如温度0-4度)也直接影响转化效率、插入片段大小及假阳性克隆的含量。●阳性克隆的挑选可通过lacZ的α-互补所形成的蓝白菌落筛选阳性克隆。●BAC文库的鉴定评价一个BAC文库质量高低的标准:假阳性克隆的含量文库中克隆的数量插入片段大小细胞器DNA的含量BAC文库的鉴定►从文库中随机挑选一定量的BAC克隆,提取质粒DNA,酶切后,脉冲电泳检查插入片段的大小►以Southern杂交来检验BAC克隆插入片段是否来源于原材料。检验假阳性克隆,保证库的质量BAC文库的快速筛选高密度膜杂交筛选Southern杂交筛选PCR筛选基因组文库在环境微生物分子生态中的应用与意义●环境样品的基因组文库能够代表自然微生物群体中的主要基因信息●为原位染色体杂交技术鉴定不可培养细菌提供可靠的信息●增加了对不可培养微生物生理、生化和关键代谢机理的了解●通过基因芯片去探测不可培养微生物的分布、基因表达和对环境的响应海洋环境BAC文库发现了海洋变形细菌视紫红质的结构模型第四节cDNA文库构建及

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