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利用彗星实验研究多氯联苯、菲对小麦根尖细胞DNA的损伤2102级环境科学王庆功2015年5月15日目录一、研究背景和研究意义二、实验设计1、实验选材及选材原因2、实验步骤三、实验可行性及可能遇到的问题分析四、实验预期成果五、参考文献研究背景与意义•1、污染现状。•由于PCBs和菲都是亲脂性化合物，一旦进入土壤，即被土壤牢固吸附，造成土壤的污染（2014，王丽娜）。据调查，我国土壤都存在不同程度的PCBs污染，淮河流域和珠江三角洲地区污染特别严重，检出率超过90%（2006，耿存珍等）。菲的污染程度也在逐步增加，从ug/kg的量级上升到mg/kg的量级，检出率达90%（2007年，刘艮梅等）。研究背景与意义•2、毒性大•多氯联苯（PCBs）和菲作为持久性有机污染物（POPs）,在我国被列入优先污染物的黑名单。具有毒性大，难降解，生物积累性等特点，对环境的毒害作用大。由于存在致突变性，往往会对植物遗传物质造成损害，例如0.05mg/L菲即可对蚕豆造成显著DNA损伤（2009年，曹玉伟等）。研究背景与意义•3、研究状况•国内外关于PCBs和菲的遗传毒性备受关注，对人类和动物危害的研究十分丰富，但是关于其对植物的遗传毒性相对较少（2014年，高熙等）。•彗星试验(cometassay)又叫单细胞凝胶电泳试验(SCGE)，是一种灵敏性高的遗传毒性研究方法，常被用作检测DNA单链和双链断裂、DNA交联等多种类型的DNA损伤（2010年，CENKCI等）。研究背景与意义•4、研究目的•本研究选择PCBs和菲作为有毒物，小麦根尖细胞作为对象进行彗星试验，旨在探讨有毒物质对根尖DNA的损伤，揭示不同污染物、不同暴露时间对DNA损伤的影响，试图为它们的早期监测和预警提供理论基础，同时也为它们对农作物的生态毒性评价提供科学依据。实验设计——实验材料•1、小麦种子。挑选饱满无病害的小麦种子，先用75%乙醇消毒5s，再用0.2％KMnO4浸泡5min，用去离子水冲洗5次，备用。•2、菲，从美国Accustandard公司购买，•3、选择以二氯、三氯、四氯为主的Arochor1242作为研究的PCBs污染物，从美国Accustandard公司购买。•4、甲醇（分析纯）选材原因•1、PCBs和菲在环境中的检出率极高，而且环境危害性极大，是国家重要监测和控制的污染物；关于它们的毒理学研究非常丰富，为我的研究作了大量铺垫。•2、小麦作为一种模式物种，广泛应用于科研项目，在杀虫剂等有毒化学物质的致突变试验方面广泛应用，另外小麦易于栽培管理，是实验成功的重要保证。实验设计——实验准备•1、将小麦种子在室温下用去离子水浸24h，期间换水2～3次。将浸泡后的种子放在铺有滤纸（霍格兰营养液）的培养皿上，在温度为(22+1)、湿度为70％条件下培养七天（2012，李云玲等）。•2、配制菲的甲醇溶解母液，然后用去离子水分别稀释母液至0.05、0.1、0.2、0.4和0.6mg/L，控制溶液中w(甲醇)0.1％。•3、配置Aroclor1242的甲醇溶解母液，然后用去离子水分别稀释母液到0.01，0.02，0.04，0.06，0.12mg/L，控制溶液中w(甲醇)0.1％。实验设计——处理小麦种子•1、选取100粒根长约3cm的小麦种子，侵泡在300ml不同污染物浓度的上述系列溶液中,黑暗，25摄氏度处理5小时，同时设不添加污染物（含等量甲醇）的对照组。•2、分别在污染物中毒害处理0、4、8、12、16、20、24h后，从溶液中取出10颗带完整根尖的小麦种子。实验设计•1、分离细胞核。取下根尖放于已在冰上预冷的玻璃培养皿，叶片冷冻10min后，向倾斜培养皿加入300ug的磷酸盐缓冲液(PBs)，用新的不锈钢刀片将根尖切成薄片，使分离的细胞核进入缓冲液。（2009年，曹玉伟等）•2、凝胶制备。本实验采用目前最常用的“三明治”3层凝胶结构，第1层为正常熔点的琼脂糖，第2层是低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液的混合层，第3层是低熔点琼脂糖。（2013年，庞振凌等）实验设计•3、裂解。待残余水分蒸发完全．将载玻片置于无菌平皿中．轻轻加入预冷的新配制的裂解混合液(pH13)浸没玻片，在常温下裂解1h，取出载玻片．去离子水轻轻漂洗2次。（张青碧等，2008）•4、DNA解旋。将载玻片置于水平电泳槽阳极端。倒入新配制碱性电泳缓冲液覆过载玻片0.25cm．放置20min，使DNA变性解旋。实验设计•5、电泳。变性结束后在稳压35V、200mA下电泳30min。•6、中和。电泳结束后取出玻片用去离子水冲洗3次．并用滤纸吸去多余的水分，放入无菌小玻璃培养皿．沿皿壁加人Tris—HCI(pH7．5)缓冲液，将载玻片淹没15min．再将Tris—HCl吸去，用滤纸将皿内液体吸干再缓缓加人无水乙醇．将载玻片浸埋1h，吸去乙醇并晾干。实验设计•7、染色与观察。每个载玻片加入30mg／mL的溴化乙锭溶液50ul染色20min后，用荧光显微镜观察，并拍照获取彗星图像。•8、记录与分析数据。计下拖尾细胞数．求出细胞拖尾率．以X2检验其显著性．同时用CASP软件分析各组平均尾长和标差．以t检验其显著性，分析评价DNA的损伤程度。数据处理1、分析同种污染物，不同浓度下，相同处理时间小麦根尖细胞DNA损伤程度。2、分析同一浓度，不同污染物条件下，相同处理时间小麦根尖细胞DNA损伤程度。3、分析同一浓度，相同污染物条件下，不同处理时间小麦根尖细胞DNA损伤程度。实验可行性分析与可能遇见的问题•可行性•1、关于彗星实验的研究已经十分成熟，为本实验的顺利进行做好铺垫。•2、小麦易于培养。•3、实验药品器材方便可取。•4、试验费用低•5、实验人有生物化学等电泳实验的基础•可能遇见的问题•1、小麦根尖小，不易操作。•2、在操作过程中可能遇到其它污染物的污染。•预期成果•1、可研报告一份•2、发表论文一篇•参考文献•[1].曹玉伟,马军,郭长虹,李蕊,余建平.植物彗星实验及其在生态毒理监测中的应用[J].生态毒理学报.2009•[2]高曦,盛月慧等.利用彗星试验研究菲对蚕豆DNA的损伤[J].生态与农村环境报.2014•[3]CENKCIS,YILDIZM,CIGERCIIH,eta1．Evaluationof2,4-DandDieambaGenotoxieilyinBeanSeedlingsUsingCometandRAPDAssays[J]．EeotoxicologyandEnvironmentalSafety，2010•[4]庞振凌,黄鹏,田亚楠.叠氮钠对小麦叶片DNA损伤的彗星实验[J].湖北农业科学.2013•[5]林爱军,张旭红,朱永官.镉对小麦叶片DNA伤害的彗星实验研究[J].环境科学学报.2005•[6]李云玲等。菲、萘对小麦种子的生态毒性效应[J].河南农业科学.2012•参考文献•[7]许峰,祁士华.三峡库区水体多氯联苯污染特征与环境交换[J].安全与环境工程.2012•[8]张青碧.蚕豆根尖细胞彗星实验研究[J].环境与健康杂志.2002•[9]王丽娜.环境中多氯联苯的污染现状、处理处置方法及概况研究[J].广东化工.2014•[10]耿存珍,李明伦,杨永亮等．青岛地区土壤中OCPs和PCBs污染现状研究[J].青岛大学学报.2006•[11]钱翌等.污染土壤中菲的修复技术研究进展[J].生态环境学报.2013•[12]吴启美，周启星.大金发藓对土壤多氯联苯污染的生态生理响应[J].植物生态学报.2015谢谢