第13章 流式细胞分析技术

第一章血液标本采集与处理临床免疫学检验技术第十三章流式细胞分析技术邵启祥目录第一节流式细胞仪的分析及分选原理一、经典流式细胞仪二、量化成像分析流式细胞仪三、质谱流式细胞仪第二节数据的显示与分析一、参数二、散射光的测定三、荧光测量四、数据显示方式目录第三节流式细胞仪免疫分析的技术要求一、单细胞免疫标本的制备二、常用的荧光染料与标记染色三、基于免疫微球技术的应用第四节流式细胞分析的临床应用一、机体免疫状态的检测二、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型三、肿瘤耐药相关蛋白分析四、艾滋病检测中的应用五、自身免疫病中的应用六、移植免疫中的应用目录第五节影响流式细胞分析的主要因素一、标本采集和单细胞悬液制备的质量控制二、荧光染色过程中的质量控制三、仪器的质量控制四、数据采集和分析过程中的质量控制重点提示本章小结概述流式细胞术（flowcytometry，FCM）：是基于流式细胞仪的一项快速、精确、高通量针对微粒（细胞）的特征或功能进行多参数定性、定量分析和分选的新型技术。流式细胞术的特点：快速、高通量、准确、灵敏、定性或定量地对完整细胞群体分析反映出细胞群体的生物学特征或功能，或根据微粒（细胞）的特征进行分选，进而研究其生物学特征和功能。第一节流式细胞仪的分析及分选原理一、概述流式细胞仪（flowcytometer）：是多学科交叉融合的产物，是集光学、化学、材料学、流体力学、自动化控制、光电测量、细胞生物学、生物化学、免疫学和计算机图像分析等技术于一体的现代化新型分析仪器。作为一种先进的微粒（细胞）定性和定量分析仪器。流式细胞仪特点：①速度快，每秒可测量数万个微粒；②精度高；③准确性好；④多参数测量，可以同时对同一个微粒作物理、化学和生物特性的多参数测量。二、经典流式细胞仪（一）基本结构经典分析型的流式细胞仪的结构组成液流系统：液流驱动系统、流动室、鞘液流和标本流信号检测：光源、光束形成器（流动室前光学系统）、流动室后光学系统转换及放大系统：光电转换器、放大器和信号处理电路计算机分析系统分选型流式细胞仪分选系统：荧光激活细胞分选系统（FACS）经典流式细胞仪的结构（二）分析工作原理荧光染色待测单细胞悬液进样器系统液流细胞流驱动系统流动室鞘液单细胞流检测区域激光激发细胞荧光素PMT/PD检测器信号放大FSC/SSC计算机信号转换、储存和分析。液流系统和液流聚焦示意图喷嘴荧光信号激光束聚焦鞘液液流系统和光学系统样品流光学系统、样品激发和FSC检测OriginalfromPurdueUniversityCytometryLaboratories光学系统、样品激发和SSC检测光学系统、样品激发和荧光检测光学系统和荧光检测（三）分选工作原理单细胞流流动室超声压电晶体高频振动散射光单细胞液滴选定细胞群体荧光信号加载电荷偏转高压静电场液滴偏转进入分选收集管，完成细胞分选数据储存，分析。细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电分选的技术要求：分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。二、量化成像分析流式细胞仪（一）基本结构量化成像分析流式细胞仪（imagingflowcytometer）的组成：荧光显微成像的形态学量化分析系统与经典流式细胞仪的结合体。液流系统：注射泵、流动室、鞘液流和细胞流LED灯明场细胞显微图像光学系统：荧光显微系统全固态激光器流式细胞仪检测检测系统：TDICCD（二）分析工作原理细胞悬液注射泵流动室液流聚焦系统鞘液LED照射极限层流抑制细胞搏动、翻转明视野细胞形态固态激光TDICCD捕获信号散射光和荧光信号计算机分析系统细胞明视野、荧光图像和流式分析图量化成像分析流式细胞仪结构、原理A.量化成像分析流式细胞仪结构图B.量化成像分析流式细胞仪结果分析图细胞核转位检测三、质谱流式细胞仪（一）基本结构质谱流式细胞仪（masscytometer）的组成质谱流式细胞仪是经典的流式技术和质谱技术的结合体。进样雾化系统离子源：热气化室和电感耦合等离子体焰炬离子传递和过滤系统ICP-TOF检测系统计算机及其分析系统质谱流式细胞仪结构简图（二）分析工作原理金属元素偶联抗体标记细胞进样器雾化系统单细胞雾化液滴离子源原子电离带电粒子高频交变电磁场雪崩式放电涡流电流离子云形成ICP-TOF检测计算机系统数据处理和分析经典流式细胞仪图质谱流式细胞仪工作原理质谱流式常用标记元素常用外周血抗CD分子抗体标记元素质谱流式细胞仪结果分析第二节数据的显示与分析一、参数流式细胞仪的主要参数有两大类：散射光信号：前向散射光和垂直散射光荧光信号：各种不同的流式细胞仪可检测的荧光信号数量不同，随着配置的激光器越多，可检测的荧光信号越多。分析型流式细胞仪最高标配4个激光器（488、633、405和375nm），可检测20个参数（18种荧光），而定制型可配置11个激光器，30个检测器，可测定32个参数。大型分选型流式细胞仪最高可配置7个激光器，检测24个参数（22种荧光），可6路分选。二、散射光的测定（一）前向散射光（forwardscatteredlight，FSC）是与细胞切线方向小角度散射光，其能反映细胞形状和体积大小。二、散射光的测定（二）侧向散射光或垂直散射光（sidescatteredlight，SSC）激光照射到细胞内容物时，可以产生方向不同和强弱不等的散射光，垂直方向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反映被检测细胞内精细结构和颗粒信息。三、荧光测量（一）荧光信号测量与放大器荧光信号由被检细胞上标记的荧光抗体上的荧光素受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。散射光和荧光的强度决定了峰值脉冲信号的高度，荧光的分布则决定了脉冲信号的宽度。这些光谱通过滤光片，不同波长的散射光和荧光信号被分开，经PMT和PD检测后，信号经放大、转换，最后通过计算机分析获取流式结果。流式检测示意图（二）荧光补偿荧光补偿是指不同的荧光素由于发射光谱重叠，因此在检测的时候有串色现象，通过减去重叠部分的光，使检测器检测到的光能量是真正的某一荧光素产生的光能量。四、数据显示方式（一）单参数数据的显示单维参数（荧光或散射光）与细胞数量（count）构成，用于FSC、SSC和荧光（FL1～FLn）等单参数的数据显示。（二）双参数图二维散点图、密度图和等高图（三）多维参数的显示假三维图和三参数点图三参数以上的显示主要要依据设门技术进行分析（四）设门分析技术Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。Region设置:区阈（region,R）与门(gate,G)是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。R3=Q1+Q2+Q3+Q4Q1=CD4+/CD3-Q2=CD4+/CD3+Q3=CD4-/CD3-Q4=CD4-/CD3+R1=为粒细胞R2=单核细胞R3=淋巴细胞M1为线性门，为是R3中的T淋巴细胞第三节流式细胞仪免疫分析的技术要求一、实验基本原则FCM试验中实验设计、对照设置、荧光抗体的选择、标本处理、染色过程和质量控制都对实验结果又重要影响。标本处理实验室环境临床标本处理的实验室环境以及废弃物的处理要严格按照实验室安全要求进行，对于传染病标本应该按照传染病的等级，按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》规定在不同等级的实验室中进行。工作人员按要求穿戴相关的防护服，仪器消毒、排放的气体、废水和实验废弃物也应按照要求进行处理。活细胞分选应该在万级层流室中进行。二、单细胞免疫标本的制备（一）标本采集、运输、保存和操作1．标本来源主要来源于外周血、骨髓和淋巴器官或组织等。2．抗凝剂的选择采用肝素钠和EDTA-Na2抗凝。EDTA的优点是防止成熟的髓系细胞贴壁造成的细胞损失，具有较强的抗血小板聚集能力。缺点是由于EDTA具有一定的消化能力，导致细胞表面的一些分子丢失。枸橼酸钠和肝素锂不宜使用。3．标本的保存新采集标本保存于室温，分离的单个核细胞标本保存于2℃～8℃。肝素抗凝外周血标本于室温保存48小时，EDTA抗凝的血标本保存24小时，骨髓标本室温保存＜18小时。最理想的保存方法，既要保持细胞原有的特性，又要不影响检测结果。常用保存方法：深低温保存法，乙醇或甲醇保存法，甲醛或多聚甲醛保存法。（二）标本制备1．外周血和骨髓1)裂解红细胞是首选方法。2)密度梯度离心在科学研究中首选。2．体液包括胸水、腹水、心包液、脑脊液和脏器的灌洗液。3．培养细胞蛋白酶消化机械吹打贴壁细胞脱落洗涤尼龙网过滤单细胞悬液。4．组织机械法、酶处理法、化学试剂处理法和表面活性剂处理法多方法组合制备单细胞悬液。二、常用的荧光染料与标记染色（一）常用的荧光染料和荧光蛋白能量传递复合染料用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。FITCPEPE-cy5Pre-CpAPCFL-1FL-2FL-3FL-4激光细胞悬液名称染料激发波长荧光颜色溶解性对PH敏感性特点异硫氰酸荧光素FITC488绿525易敏感易溶于水，与抗体结合不影响特异性藻红蛋白PE488橙575易不敏感具较多发光基团，消光系数和量子产额高别藻青蛋白APC633红670能量传递复合染料PE-cy5488红670易不敏感减少交叉，成本高能量传递复合染料机制PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷5藻红蛋白名称染料激发波长荧光颜色溶解性对PH敏感性特点异硫氰酸荧光素FITC488绿525易敏感易溶于水，与抗体结合不影响特异性藻红蛋白PE488橙575易不敏感具较多发光基团，消光系数和量子产额高别藻青蛋白APC633红670能量传递复合染料PE-cy5488红670易不敏感减少交叉，成本高（二）免疫荧光标记荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式嵌入结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法直接标记：干扰少，但需购买多种单抗，在流式分析中大量使用。间接标记：步骤多，干扰多，不需标记多种抗体组合标记。在流式标记中很少使用。抗体和标记方式的选择首选直接标记抗体荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，荧光较弱，适用于强表达抗原间接标记：不提倡用实验对照的设计原则空白对照：所有试验必须设置阴性对照：常用同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时CBA技术++抗原（细胞因子）荧光标记抗体捕获荧光微球捕获抗体荧光微球三、基于免疫微球技术的应用不同荧光强度微球CBA流式检测结果和标准曲线第四节流式细胞分析的临床应用流式细胞术目前已广泛地被应用于基础研究、临床诊断和研究应用各方面，特别是在免疫细胞的表型、功能分析和免疫相关性疾病的诊断、治疗和预后判断中具有重要的意义。一、机体免疫状态的检测（一）淋巴细胞及其亚群的分析1．T淋巴细胞及其亚群Th(CD3+CD4+CD8-T)：Th1、Th2、Th17、Th22Tc(CD3+CD4-CD8+T)Treg（CD3+CD4+CD8+T）2．B细胞及其亚群B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体,参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关。B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体；活化的B细胞可表达CD83。3．NK细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)4．树突状细胞浆细胞样树突状细胞（lymphoiddendriticcell，LDC）：CD11c-CD3