2第十三章 酶类药物

第十三章酶类药物第一节药用酶概述•大多数酶制剂为口服剂型，现能由于注射的酶制剂只有细胞色素C、纤溶酶等少数几种。•目前对药用酶的研究热点是，在维持活性状态下的酶蛋白能否被吸收，如何将少药用酶的抗原性问题及新型药用酶的研究等。一、药用酶的分类及应用（一）促进消化酶类（二）消炎酶类（三）与治疗心脑血管疾病有关的酶类（四）抗肿瘤的酶类（五）与生物氧化还原电子传递有关的酶（六）其他药用酶二、药用酶的来源和生产（一）药用酶的来源酶作为生物催化剂普遍存在于动植物和微生物中，可直接从生物体中分离获得。酶可以通过化学合成法合成，但由于各种因素的限制，目前药用酶的生产主要是直接从动植物种提取、纯化和利用微生物发酵生产。近10多年来，动植物细胞培养技术取得了很大的进步，但因为周期长，成本高等问题，实际应用还有一定困难。目前工业大规模生产一般都是以微生物为主要来源。（二）生化制备法生化制备法的主要生产过程为：1、原料选择应注意的问题（1）了解目的酶在生物材料中的分布特点，选择适宜的生物材料。（2）考虑生物在不同发育阶段及营养状况时，酶含量的差别及杂质干扰的情况。（3）用动植物组织作原料，应在动物组织宰杀后立即取材。（4）考虑生化制备的综合成本。2、生物材料的预处理（1）机械处理（2）反复冻融处理（3）制备丙酮粉（4）微生物细胞的预处理3、酶的提取（1）水溶液法常用稀盐溶液或缓冲液提取，经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒，丙酮粉都可用水溶液抽提。水溶液的pH选择对抽提具有影响，应考虑的因素有：①酶的稳定性②酶的溶解性③酶与其他物质结合的性质④选择pH的总原则是，在酶稳定的pH范围内，选择偏离等电点的适当的pH。（2）有机溶剂法某些结合酶，由于和脂质结合牢固，需用有机溶剂除去脂质，且不能使酶变性。常用有机溶剂是丁醇。①丁醇性质：亲脂性强、兼具亲水性、在脂与水分子间能起表面活性剂的桥梁作用。②丁醇提取方法：均相法和两相法（3）表面活性剂法4、酶的纯化不同的酶，因性质不同，其纯化工艺可能有很大不同。评价一个纯化工艺好坏，主要看两个指标：酶比活和总活力回收率。纯化过程中的技术难点：（1）杂质的除去①调pH和加热沉淀法②蛋白质表面变性法③选择性变性法④降解或沉淀核苷酸法⑤利用结合底物保护法除去杂蛋白（2）脱盐①透析②凝胶过滤（3）浓缩①冷冻干燥法②离子交换法③超滤法④凝胶吸水法（4）酶的结晶①酶的结晶方法盐析法、有机溶剂法、复合结晶法、透析平衡法、等电点法②结晶条件的选择•酶液的纯度•酶的浓度•温度、时间、pH、晶种、结晶器皿处理（5）酶分离和纯化中应注意的问题①防止酶蛋白变性②防止辅助因子流失③防止酶被蛋白水解酶降解（三）微生物发酵法1、高产菌株的选育获取优良菌株有三种途径：从自然界分离筛选用物理或化学方法处理、诱变用基因重组与细胞融合技术，构建性能优良的工程菌。2、发酵工艺的优化3、培养方法（1）固体培养法（2）液体培养法4、影响酶产量的因素（1）温度：一般发酵温度比种子培养时略高，对产酶有利。（2）发酵的pH：可通过培养基原始pH或添加缓冲剂或通过调节通气量等方法实现。（3）通气和搅拌①用于酶生产的微生物，基本都是好氧菌；不同菌种在培养时，对通气量的要求也不同。②搅拌能使气泡打碎，增加气液体接触面积，加快氧的溶解速度；搅拌使液体形成湍流，延长气泡在培养液中的停留时间，提高空气的利用率；搅拌可增加液体的湍流作用，有利于热交换和营养物质与菌体细胞的均匀接触，同事稀释细胞周围代谢产物，有利于促进细胞的新陈代谢。（4）泡沫和消泡剂①气泡对发酵过程的影响•发酵过程中，泡沫的存在会阻碍二氧化碳排除，影响微生物生长和产物的形成；•泡沫层过高，往往造成发酵液随泡沫溢出罐外，浪费原料，还容易染菌；•泡沫层过高还会降低发酵罐的利用率。②常用消泡剂：天然油类，醇类，脂肪酸，胺类，酰胺类，磷酸酯类，聚硅氧烷等。其中以聚二甲基硅氧烷为最理想的消泡剂。（5）添加诱导剂和抑制剂第二节重要酶类药物的性质及生产方法一、胃蛋白酶（一）组成与性质①淡黄色粉末，具有肉类特殊的气味及微酸味；②吸湿性强、易溶于水，水溶液呈酸性。可溶于70%乙醇和pH=4的20%乙醇中。难溶于乙醚、氯仿等有机溶剂。③干燥的胃蛋白酶较稳定100度加热10min不会被破坏；在水中，70度以上或pH=6.2以上开始失活，pH=8以上呈不可逆失活；酸性溶液中较稳定，但在2mol/L盐酸中会慢慢失活。最适pH=1.5-2.0。④结晶胃蛋白酶呈针状或板状，电泳可分出4个组分，其组成元素有N、C、H、O、S、P、Cl。⑤胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物，尤其对两个相邻芳香族氨基酸构成的肽键最为敏感。它对蛋白质水解不彻底，产物为胨、肽和氨基酸的混合物。（二）生产工艺1、工艺流程2、工艺过程及控制要点①酸解，过滤②脱脂，去杂质③浓缩，干燥3、胃膜素和胃蛋白酶联产工艺①胃膜素也是从猪胃粘膜中提取的一种黏蛋白。胃膜素水溶液能被60%以上的乙醇或丙酮沉淀，所以可利用提取胃膜素的母液制备胃蛋白酶。②联产工艺：向分离胃膜素的母液中，边搅拌边加冷丙酮，至相对密度0.91，既有淡黄色胃蛋白酶沉出，静置过夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。4、结晶胃蛋白酶的制备（三）质量控制1、质量标准2、活力测定二、尿激酶是一种碱性蛋白，由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿中。人尿中平均含量5-6IU/mL。临床上尿激酶已经广泛用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。（一）结构与性质①存在多种相对分子质量形式，主要的有31300、54700两种。②尿中存在尿胃蛋白酶原，酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶，可以把分子量54700的天然尿激酶降解成分子量31300的尿激酶。③尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必须氨基酸。④尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，尿激酶也有酯酶活力。⑤尿激酶PI为8-9，溶液中不稳定，冻干可稳定数年。（二）生产工艺1、工艺流程（三）质量控制成品为白色或米色澄清溶液或白色冻干粉。每毫克蛋白的酶活力不得低于120000IU。尿激酶活力测定方法：（1）气泡上升法①试剂：血纤维蛋白原溶液、牛凝血酶溶液、血纤维溶酶原溶液、尿激酶标准品溶液。②反应体系：四种溶液的混合体系。③操作：12mm*75mm小试管，置于冰水浴中，依次加入上述溶液，迅速搅拌，立即置于37度水浴保温。反应体系应在30-45s凝结，凝块内有小气泡生成。当凝块溶解时，气泡逐渐上升，在气泡上升到反应体系体积一半时作为反应终点。④标准取消：以酶浓度为纵坐标，凝块溶解时间为横坐标，绘制标准曲线。⑤样品测定：被测样品稀释成10-20IU/ML，同以上操作，根据凝块溶解时间，从标准曲线查得样品的活力单位。（2）平板法三、门冬酰胺酶（一）结构与性质①门冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，可用于治疗白血病。②呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。③20%水溶液，室温储存7天，5度储存14天均不减少酶的活力。干品50度，15min酶活力降低30%，60度1h内失活，最适pH=8.5，最适作用温度37度。（二）生产工艺1、工艺流程2、工艺过程及控制要点（三）活性测定方法①测定原理：门冬氨酸酶催化天冬酰胺水解，释放游离氨。奈斯勒试剂与氨反应后形成红色配合物，可借比色法进行定量测定。②实验过程：取0.04mol/L的L-天冬酰胺1ml，0.5mol/LpH=8.4的硼酸缓冲液、0.5ml细胞悬浮液或酶液，于37度水溶液中保温15min，加15%三氯醋酸0.5mL，以终止反应。沉淀细胞或酶蛋白，离心，取上清液1mL。加2mL奈斯勒试剂和7mL蒸馏水15min后，于500nm波长下比色测定产生的氨。③活力单位定义：每分钟催化天冬酰胺水解1umol氨的酶量定为一个活力单位。四、超氧化物歧化酶（SOD）•SOD是一种重要的氧自由基清除剂，能专一清楚超氧阴离子自由基。•目前SOD临床应用集中在自身免疫性疾病上，也可用于抗辐射，抗肿瘤，治疗氧中毒，心肌缺氧与缺血再灌注综合症一级某些心血管疾病。•SOD属于重金属酶，广泛存在于动植物、微生物细胞中。（一）结构和性质SOD的性质不仅取决于蛋白质部分，还取决于活性中心金属离子的存在，金属离子种类不同，SOD的性质有所不同，其中Cu，Zn-SOD与其他两种SOD差别较大，而Mn-SOD与Fe-SOD之间差别较小。1、SOD活性中心和构象2、SOD的理化性质SOD是一种金属蛋白，因此它对热、pH及其在某些性质上表现出异常的稳定性。（1）热稳定性（2）pH对SOD的影响•在pH=5.3-10.5范围内对SOD活性不受影响。•pH=3.6时SOD中Zn要脱落95%。•pH=12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变，从而导致酶活性丧失。（3）吸收光谱•取决于酶蛋白和金属辅基。•紫外光谱区：250nm-270nm•可见光区：680nm4、金属辅基与酶活性Cu与Zn的作用是不同的•Zn仅与酶分子结构有关，而与催化活性无关。•Cu与催化活性有关，透析除去Cu则酶活性全部丧失，一旦重新加入Cu，酶活性又可以恢复。（二）生产工艺1、收集红细胞2、溶血、去血红蛋白3、沉淀、热变性4、柱层析5、冷冻干燥（三）检测方法1、SOD的纯度鉴定（1）均一性（2）酶比活（3）理化性质2、SOD活性测定五、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）•一类存在于人体组织中的组织激活剂。主要由血管内皮细胞和组织细胞合成，存在于哺乳动物血浆中。•主要作用：作用于纤维蛋白溶酶原，特异性裂解溶酶原中的精氨酸-缬氨酸键。t-PA与纤维蛋白结合产生的t-PA-纤维蛋白复合物，能高效、特异地激活血凝块中的纤溶酶原，因此是一种高效特异性血栓溶解药物。•t-PA释放减少见于高脂血症病人，尤其是高三酰甘油血症、肥胖症、口服避孕药等的病人。•t-PA的活性在夜间及清晨最低，白天可增高达3倍，说明内皮细胞合成与分泌t-PA还与时间有关。（一）氨基酸特征（二）理化性质及生物学活性t-PA的等电点在7.8-8.6之间，稳定pH为5.8-8.0，最适pH为7.4；t-PA在枸橼酸抗凝血浆中不稳定，其活性丧失速度与温度有关。（三）t-PA的生产可利用动物细胞培养技术，培养人黑色素瘤细胞株，产生大量的t-PA，其培养液中t-PA浓度可达到1ml/mL。1、工艺流程2、工艺过程及培养要点①培养基：主要为Eagle培养基。②t-PA抗体制备得到抗t-PA的免疫球蛋白G。③抗t-PA亲和吸附剂制备④细胞培养⑤t-PA的分离⑥精制