《饭店管理概论》期末总复习

第二章基因工程制药技术获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌（或细胞）培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装制备基因工程药物的一般程序上游阶段下游阶段基因工程菌构建流程一表达载体构建表达载体设计目标基因的定位克隆酶切反应连接反应转化筛选与鉴定1.表达载体的设计表达载体概念：expressionvector在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达盒所构成。外源基因表达盒(操纵子模型)：2、目标基因PCR定位克隆PCR循环PCR扩增的反应体系组成模板DNA：目标序列,100－10000bp,pg引物：两条寡核苷酸，21～27bp。脱氧核苷酸：4种dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPDNA聚合酶:Taq聚合酶，耐高温缓冲溶液：50mMKCl、10mMTris-HCl,1.5mMMgCl23.酶切反应和连接反应限制性核酸内切酶连接酶4.转化、筛选与鉴定非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞转化子：导入外源DNA的转化细胞非重组子：仅含有空载体分子的转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子目标重组子：含有连接正确的重组分子（目的）非目标重组子：不含目的基因重组子转化后的细胞类型筛选方法将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。（1）遗传学方法•A.抗生素筛选法•a.单抗生素筛选•大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（ampicillin,Amp）、四环素(tetracycline,Tet)、卡那霉素(kanamycin,Kan)抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。•b.双抗生素筛选双抗生素筛选结果示意图•B.蓝-白筛选（α互补）•许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α互补。因此，当载体的多克隆位点没有插入外源DNA片段时，α互补能正常进行，产生有活性的β-半乳糖苷酶。能使人工底物X-gal变成蓝色,产生蓝色菌斑或菌落。如果载体的多克隆位点插入了外源DNA片段，导致产生无α互补能力的氨基端片段,带重组体的细菌形成白色菌斑或菌落。（2）免疫学方法•如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。（3）核酸杂交法•对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。菌落原位杂交的原理鉴定方法•菌落PCR：是否含有目标基因•载体大小：电泳检测•酶切鉴定：插入片段大小及插入方向•测序确证：目标基因的序列准确无误，阅读框架通读二基因工程菌的构建•基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。•基因工程菌种类：细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。1.大肠杆菌表达系统细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。大肠杆菌表达系统是发展最早、应用最广泛的经典的表达系统优点：•遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70％），培养周期短，抗污染能力强缺点：•以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性•不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达•细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热原基因工程大肠杆菌的应用多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)细胞因子类：5种干扰素α（1种PEG化）、干扰素β和γ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂溶栓酶类：rPA白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等PEG•聚乙二醇（PEG）是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相容性的高分子聚合物，也是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。•具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。当藕联到药物分子或药物表面时，能防止肾小球滤过减少免疫原性阻止蛋白酶降解2.酵母表达系统细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。优点：•安全、无毒。•营养缺陷选择外来质粒。•培养条件简单、大规模培养技术成熟。•亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点：•酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。•修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。基因工程酵母的应用•1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素；细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子多肽类：高血糖素2种乙肝疫苗等。水蛭素•水蛭素：从水蛭唾液中提取的天然特效凝血酶抑制剂•天然水蛭素是由65个氨基酸组成的多肽化合物，在低于70摄氏度的环境温度下都能保持活性。它溶于水，能够阻止血液中纤维蛋白的凝固，抑制凝血酶与血小板的结合，有极强的溶解血栓作用。•重组水蛭素是用基因工程通过大肠杆菌、噬菌体或酵母菌表达产生，其氨基酸序列和结构与天然水蛭素唯一不同的是其63位酪氨酸残基未硫酸化，该特点使其对凝血酶的抑制作用明显降低，仅为天然水蛭素的1/10。但这种方法能获得相当量的重组水蛭素，所以极大地推动了水蛭素的药理、临床等方面研究工作的深人开展。三基因工程菌的培养与发酵•（1）培养基组成与控制碳源氮源无机盐选择剂诱导物碳源大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。浓度稍高后就表现出底物抑制作用。葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。氮源直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高的选择性。大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸为氮源无机盐磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态基因工程菌生长提供必需的矿物质。选择剂selectiveagent维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。发酵培养过程中质粒容易丢失，使之成为宿主菌为了保证质粒的稳定性，不丢失，根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加或缺陷选择剂。诱导物•诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。•诱导物成为产物表达必不可少的。•Lac启动子表达系统：IPTG诱导。•甲基营养型酵母：加入甲醇进行诱导2.培养工艺与控制温度溶解氧pH大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度为10℃大肠杆菌生长最适温度为37℃，最高温度为45℃。酿酒酵母生长最适温度为30℃，最高温度为40℃。温度对工程菌发酵的影响两段变温发酵培养：前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37℃，生产期提高温度42℃。温度控制pH值对发酵的影响细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.5～7.5，真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.0～6.0。影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。干扰素是在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。pH值控制了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，需要进一步设法控制pH在合适的范围内。分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。溶解氧控制工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力考虑溶氧对质粒稳定性的影响：调节搅拌转速和通气量四重组人干扰素生产工艺概念：（interferon，IFN）•机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类似、功能接近的细胞因子功能：干扰病毒在细胞内的繁殖天然干扰素分类：•􀀹I干扰素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNε、IFNω•􀀹II干扰素：IFNγ上市重组干扰素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ研发中的重组干扰素：IFNω，临床阶段广谱抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）􀀹毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）多发性硬化症rhuIFNβ重组干扰素的临床应用体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞干扰素生产工艺路线（1）1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市产量低：1gIFNα，需要3亿ml人血白细胞来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可能性人源转化细胞系培养生产工艺：干扰素生产工艺路线（2）1999年：IFNα-n1/Wellferon,批准用于临床。优点：首次实现大规模商业化生产。缺点：活性低，退出临床应用。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺：干扰素生产工艺路线（3）上市产品：重组人干扰素rhuIFN􀀹1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；􀀹1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；􀀹2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。干扰素生产工艺路线（4）动物无限细胞系培养生产工艺：上市产品：rhuIFNβ-1a􀀹1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表达产物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonasputida）上市产品：IFNα-2b/安福隆表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性工艺特点：􀀹发酵周期短：几个小时􀀹无需变性、复性过程，获得有活性产品􀀹纯化过程：淘汰抗体亲和层析干扰素生产工艺路线（5）五转基因动物技术主要步骤：•获取外源目的基因•外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞•选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物•转基因胚胎的发育及鉴定•筛选所得的转基因动物•经典的技术路线目的基因显微注射已交配的取出移植受体动物妊娠供体动物受精卵输卵管转基因动物缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。转基因动物的技术路线•整合胚胎移植的技术路线转基因动物受体动物子宫目的基因非手术胚胎移植体外受精体外培养多细胞胚胎检测整合外源基因卵子受精卵或囊胚的胚胎精子优点：受精卵的成活率高达90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。转基因动物的技术路线（续）转基因动物的技术路线（续）•核移植（克隆）的技术路线目的基因转基因动物导入动物胎儿成纤维细胞妊娠取核动物去核重组的体外培养囊胚期胚胎移植卵细胞受精卵胚胎受体动物子宫•特点：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。转基因动物的技术路线（续）•整合卵受精的技术路线：目的基因转基因动物导入逆转录病毒妊娠精子感染体外受精胚胎移植卵母细胞成熟卵细胞