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地中海贫血的实验室检测及临床应用深圳益生堂生物企业有限公司主要内容地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的实验室检测及应用少见型地中海贫血应用范例技术服务简介红细胞血液中数量最多的一种红细胞运送氧气功能红细胞中含有血红蛋白，因而使血液呈红色。血红蛋白合成不足或不能合成，引起贫血。血红蛋白成人血红蛋白HbA由两条α珠蛋白链和两条β珠蛋白链组成，每条肽链有一个包含铁原子的环状血红素血红蛋白病概念由编码珠蛋白的基因突变引起珠蛋白肽链异常所致的疾病统称血红蛋白病。分为两种情况：1、异常血红蛋白病：基因突变导致珠蛋白肽链结构发生改变。（珠蛋白的一级结构发生改变的血红蛋白）2、地中海贫血：基因突变导致珠蛋白肽链合成量减少。地中海贫血是血红蛋白病的重要类型之一血红蛋白病的分类地中海贫血概念地中海贫血是由于珠蛋白基因的缺失或缺陷使某种蛋白链合成受到抑制而引起的溶血性贫血，为单基因遗传病。典型的常染色体隐性遗传病。主要有两种类型：α-地中海贫血β-地中海贫血地中海贫血临床特征（中、重度）小细胞低色素性溶血性贫血黄疸肝脾肿大（脾大明显）骨髓增生生长发育迟缓合并感染Bart’s水肿胎输血依赖性地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的遗传规律人体不同发育时期的血红蛋白及其组成人体不同发育时期的珠蛋白表达规律蛋白链发育阶段特异性的临床意义胎儿血红蛋白为α2γ2所以α地贫的纯合子(α基因不表达）,由于不能合成α肽链，出现HbBarts水肿胎,宫内发生严重贫血。（孕妇可发生妊娠高血压综合征、巨大胎盘、产后出血等并发症）胎儿期的β链是低水平表达，以γ链表达为主，所以β链的减少对胎儿期无影响，出生后头几个月γ链逐渐被β链取代，故重型β地贫一般在出生几个月才出现贫血。（贫血逐渐加重，肝脾大，反复输血和去铁治疗）胎儿重型α地贫和成人HbH病的病理生理学机制中国南方α和β地贫的人群携带率非缺失型α地贫广西地区5789例样本中异常血红蛋筛查结果类型携带率αWS1.55%αQS0.36%αCS1.21%α和β病理学机制和临床分类主要内容地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的实验室检测及应用少见型地中海贫血应用范例技术服务简介α-地贫的概念由于α珠蛋白基因缺失或点突变，使α链合成受到抑制而引起的贫血。α-基因缺陷α-链不足α-地贫16p13正常人共有4个α基因(每条16号染色体上有2个)正常人共有4个α基因(每条16号染色体上有2个)有4个α基因(每条16号染色体上有2个)α地贫分子基础有两种分子机制引起α地贫：缺失型α地贫，占α地贫的95%以上，由α基因缺失引起。非缺失型α地贫，占α地贫约5%，由α基因点突变引起。17种引起α珠蛋白表达降低的常见缺失突变中国南方人群12种非缺失型α地中海贫血的突变谱α-地贫的分类静止型α地贫轻型α地贫HbH病HbBart’s巴氏胎儿水肿综合症静止型α地贫基因型：一个α-珠蛋白基因缺失或突变。表示为：-α/αα或αTα/αα(αT表示突变型）临床表现：无症状，血常规正常Hb电泳分析：新生儿：HbBart’s0.5%〜1%。成人：Hb电泳难以检出静止型α地贫地贫筛查常发现不了，需要作基因检测，但若和α0地中海贫血杂合子通婚后则有可能生育较严重的HbH病患儿。常见有：-α3.7/αα、-ɑ4.2/αα、ααWS/αα轻型α地贫基因型：2个α-珠蛋白基因缺失或每条染色体上各有一个基因缺失或缺陷表示为：--/αα或-α/-α或-α/αTα临床表现：无明显症状；红细胞脆性降低（60%）；MCV80fl；MCH27pg；Hb正常或轻度下降亨氏小体可能阳性血象：小细胞低色素性贫血Hb电泳分析：新生儿：HbBart’s1%〜10%成年人：HbA2≤2.5%HbH病基因型：3个α-珠蛋白基因缺失或突变表示为：--/-α（--/αTα）临床表现：α链的合成受到严重影响，大量的β-珠蛋白链过剩而聚合为β四聚体—HbH（β4），使红细胞受损，导致慢性溶血性贫血。有轻度或中度贫血，部分患者伴肝脾肿大及轻度黄疸，较重者亦需输血治疗。感染和服用氧化性药物及妊娠均可使贫血加重。HbH病2类HbH病的血液学参数比较α地贫疾病严重程度的单倍型顺序α2约占基因表达量的2/3,α1基因占1/3HbBart’s胎儿水肿综合征基因型：四个α-珠蛋白基因缺失或突变表示为：--/--临床表现：α链不能合成，γ链聚合成HbBart’s(γ4)，氧亲和力高，造成组织缺氧坏死，导致早产、死胎，个别能活到足月，也会于出生几小时内死亡。胎儿有苍白、水肿、肝脾肿大，胸腹腔积液，大胎盘。孕妇容易合并妊娠高血压综合征及产后出血等并发症。Hb电泳分析：HbBart’s70~80%Hbportland（ζ2γ2）7~25%HbA0HbF0胎儿水肿（一）胎儿水肿（二）中国人常见的缺失型α地贫α0地贫：一条染色体上缺失两个连锁的α基因，即α1和α2基因都缺失，如--SEA/，又称东南亚缺失型;--THAI/,又称泰国型缺失。α+地贫：是一条染色体上缺失1个α基因（α1或α2），分两种：-α3.7（右侧缺失）：缺失α2的3`端和α1的5`端，缺失片段约3.7kb。-α4.2（左侧缺失）：α2基因完全缺失，α1基因完整，缺失片段为4.2kb。由于α2基因的表达水平占整个α基因表达量的70%左右，理论上左缺失型比右缺失型对α基因表达的影响大。实验室检测诊断技术筛查+基因检测：1、血细胞自动分析技术：获取数据：RBC、HGB，MCVMCH等数据。2、血红蛋白分析：获取数据：HbA、HbA2、HbF以及一些异常血红蛋白3、Gap-PCR：获取数据：缺失型α、缺失型β4、反向点杂交（RDB)）：非缺失型α、βα缺失型地贫的诊断（Gap-PCR法）益生堂检测中国人群常见4种α-地中海贫血缺失型：--SEA，-α3.7，-a4.2和--THAI；国内唯一获得CFDA批准检测泰国型缺失的试剂，扩大了检测范围，减少漏诊风险;。可用于抗凝外周血样本、羊水样本或胎绒毛样本等。灵敏度高。单管多重PCR，检测流程简便、快速，结果准确、可靠。Gap-PCR检测缺失型α地中海贫血基因非缺失型α的诊断（PCR探针法）益生堂检测中国人群中常见的3种α2基因点突变:αCS、αQS、αWS检测非缺失型α和β地贫基因时各项控制参数相同，可同机扩增、同管杂交、洗涤、显色杂交时间灵活（可杂交2-18小时），便于合理安排实验时间非缺失型α地贫基因检测（RDB法）3种非缺失型α地贫突变位点(αWSα,CAC˃CAG;αQSα,CTG˃CCG;αCSα,TAA˃CAA)α地贫的遗传咨询（一）α地贫的遗传咨询（二）α地贫的遗传咨询（三）α地贫产前诊断指征（一）夫妇双方都携带--SEA/αα夫妇双方都携带--THAI/αα夫妇一方为--SEA/αα另一方为--THAI/αα有1/4的机会生育HbBart՚s水肿胎，需要产前诊断。α地贫产前诊断指征（二）一方为--SEA/αα或--THAI/αα,其配偶为αTα非缺失型α突变（突变型为CS、QS）,需要产前诊断。α地贫诊断小结首先夫妇双方做地贫筛查（血常规+Hb分析）筛查提示α-地贫时，双方做α-基因检查（注意同时检查缺失及非缺失α基因）若基因结果出现α-地贫产前诊断指征，需要做产前诊断根据具体情况选择产前诊断方法胎儿为HbBarts水肿胎时，建议终止妊娠；为HbH病时，根据病人意愿处理β地贫分子基础大部分β基因点突变和少部β基因缺失β地贫的概念由于β珠蛋白基因的突变，引起血红蛋白β链合成的减少或缺乏而形成的溶血性贫血。β-基因缺陷β链不足β地贫β基因在11号染色体上（11p15），每条染色体上有1个基因。β珠蛋白基因突变及其对基因功能的影响β0:β珠蛋白链不能合成β+:β珠蛋白链合成减少中国南方人群46种β地贫点突变谱及其功能影响β珠蛋白基因突变及其对基因功能的影响β地贫常见的基因缺失突变β地贫病临床表现及分型β地贫病临床表现及分型注：根据人体不同发育时期的血红蛋白及其组成，胎儿发育直至出生时β基因低水平表达，导致β地中海贫血的突变对基因的抑制作用在出生时难以显示，因此重型β地贫患儿出生时不会表现出疾病类型。出生后几个月发病（1周岁内）基因确诊！β地贫基因型与表型的关系夫妇双方均为β地贫携带者（β0或β+），有1/4的机会生育中、重型β患儿。β地贫的实验室检测1、筛查：筛查指标（与前述α-地贫一样）：血常规+Hb分析仪器：红细胞计数仪、Hb电泳仪或高效液相分析仪筛查阳性：MCV〈80fL，MCH27pgHbA23.5%HbA2升高对判断β-地贫至关重要，几乎可筛查出所有β-地贫基因携带者。β地贫的实验室检测2、β地贫的基因检测PCR-RDB法注意：大部分所用基因检测方法只检测常见的17个β基因点突变，不能检查少见或罕见的点突变。当检测阴性时，应结合HbA2值判断。β地中海贫血基因检测试剂盒（PCR探针法）（益生堂）起始样本为抗凝人全血，羊水或胎绒毛。检测高通量，一份标本只需做一管PCR即可鉴别临床意义重大的17种β点突变。全过程大约6-8小时。寡核苷酸探针杂交，特异性高，操作简便，重复性、稳定性良好易于推广应用，凡能开展PCR实验的单位(有PCR仪和分子杂交炉/恒温水浴摇床)均能采用本试剂盒。与非缺失α-地中海贫血基因检测试剂盒扩增条件相同。采用相同的扩增和杂交参数，一台PCR仪同时扩增，同管杂交，且同一份杂交物可经过1-2次的重新杂交，可进行结果的复核与验证。检测原理(PCR-RDB用于检测α和β点突变)重型β地贫：β0突变双重杂合子β地贫复合α地贫指同时携带有β地贫和α地贫，因为是不同类型的地贫，患者一般无症状。地贫筛查的表现同β地贫（MCV↓,HbA2↑），因此无法与单纯的β地贫区别开。检查β地贫携带者的α地贫基因是唯一的区别方法。β地贫复合α地贫因此，当夫妇双方的一方是α地贫，另一方是β地贫时，β地贫携带者应检查α地贫基因。若是β地贫复合α地贫，则根据情况产前诊断。β地贫复合α地贫示例β地贫复合α地贫示例基因诊断方法Gap-PCR技术，缺失型α-地中海贫血基因检测的首选方法PCR-探针法(RDB)技术，β-地中海贫血突变基因检测、非缺失型α-地中海贫血突变基因检测的首选方法MLPA(缺失型α、β分子诊断技术）DHPLC（β地中海贫血突变分析）DNA序列测定法（directsequencing,DS）基因突变检测方法的金标准高分辨熔解曲线分析系统（HRM或HRMA）:DNA序列突变的检测主要内容地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的实验室检测及应用少见型地中海贫血应用范例技术服务简介少见型地贫基因检测指征及流程示例一：β地贫的基因诊断（基因测序）试剂盒检测范围只包括17个β基因点突变，不能检测少见或罕见的点突变，当检测到阴性时，应结合HbA2值综合判断。β地贫的基因诊断(基因测序）7195测序结果：在nt397处出现双峰，G＞A，对应于CD37(TGG＞TAG)，已知文献报道与β-地贫有关。示例一中β地贫的基因诊断(基因测序）示例二：β地贫的基因诊断（基因测序）2015年11月深圳市医院，1孕妇遗传咨询父亲41-42M杂合子母亲未检出17种β突变先证者（？岁）夫妻俩第一个孩子检出41-42M杂合子但每月需定期输血！母亲可能存在试剂盒检测范围外的突变，先证者、母亲均进行β测序母亲：CD8-9(+G)突变，已知文献报道与β-地贫有关先证者：CD8-9(+G)和CD41-42（-TCTT）突变胎儿：未检出β突变（测序结果有效范围：β珠蛋白基因-90至IVS-2-100、IVS-2-500至3，PolyA部分，包含了«地中海贫血预防控制操作指南»中报道的46种中国南方人群β-地中海贫血突变位点及在此区域内的未知突变位点。）示例二中先证者测序图示例二中先证者测序图示例三：β地贫基因检测（缺失型β）父亲：--SEA/αα27-28M/27-28M母亲：--SEA/ααβN/βN胎儿(脐血）：αα/ααβN/