35微生物药物的发酵生产技术

第二章微生物制药一、微生物药物的几个相关基本概念二、微生物药物的分类三、微生物药物的应用四、药源微生物及微生物药物的筛选技术五、微生物药物的发酵生产技术六、微生物药物的分离、精制和鉴别七、废弃物的综合利用和环境保护五、微生物药物的发酵生产技术发酵菌种种子制备发酵生产发酵液预处理产品提取和精制成品检验成品分包装发酵废液的环保治理（一）微生物药物工业生产菌种工业生产用菌株不同于实验室研究菌株，不但要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追求产量尽可能的高，作为目标产品的类似物尽可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。因此。在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、复壮和改良。1、药物生产菌株注意生产菌株的产物合成潜能和产物合成的稳定性。工业生产菌株应满足的要求：能够产生较高浓度的目标产物；微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物；产物便于分离提取；能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物质等；不致病，不产生内毒素；发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态，即发酵条件较温和；容易进行代谢调控。（1）产生菌株的筛选直接从国内外的各种非盈利的微生物菌种保藏中心购买生产菌株的改良——重组DNA技术和常规诱变筛选的结合（2）生产菌株的纯化不断纯化高产性状的菌株筛选遗传上稳定的菌株（3）理化诱变及筛选细胞的准备诱变剂的选择诱变处理的效率突变株的分离（4）生产菌株基因重组改良¤自然繁育系统¤原生质体融合¤基因工程2、生产种子的制备种子制备的一般流程沙土管冻干管液氮管一级斜面子瓶母瓶米孢子二级斜面一级种子罐发酵罐三级种子罐二级种子罐生产现场种子制备实验室种子制备保藏菌种（1）生产菌种的保藏制备基本原则：低营养干燥缺氧低温密封（2）实验室种子制备斜面菌种制备短期存放斜面菌种要求丰富的孢子和营养菌体细胞斜面应软硬适中，光滑，表面无游离水，无污染，斜面长不超过试管2/3。制备好的斜面菌种要求无污染，外观生长均匀，孢子或菌体丰满，无杂菌杂色等。米孢子的制备质量要求：无污染，孢子数足，发芽率高，生产能力稳定。影响米孢子质量的因素：米的质量——用优质品种、新米；米的湿度——以灭菌后不结块为准；营养液成分大米/小米水洗沥干孢子悬液斜面孢子或米孢子分装灭菌摇匀培养米孢子调pH营养液米孢子的制备工艺流程摇瓶种子的制备摇瓶种子提供的通常是丰富的营养菌体细胞。要求无污染、生产力高、菌体浓度高、处于生长阶段。要求培养基组成丰富而均衡，控制液体装瓶量，一般：40-50ml/250ml，60-80ml/500ml，80-100ml/750ml（3）种子罐种子的制备种子罐的种子制备以生长营养菌体为目的，种子罐的级数应随产物的品种及生产规模而定，也随工艺条件的改变做适当调整。细菌发酵一般采用二级种子发酵，即经过斜面菌种、一级摇瓶种子、二级种子罐培养、大罐发酵的过程。放线菌常用三级扩大的方法培养种子。生产现场，一级种子罐用火圈法或压力差法接种，二、三、四级种子罐用压力差法接种。一般种子罐之间的接种量在5%-10%，种子罐到发酵罐之间的接种量可以控制在20%-30%。种子罐的控制内容包括细胞代谢状态、发酵液中的残糖和氨氮含量、pH变化、细胞的呼吸活性等。为了菌体细胞进入发酵罐后能很快的适应发酵培养基条件，应该在最后一级种子罐配料上加入适当的发酵培养基条件，如pH、消泡剂。3、药物生产菌的生长和产物合成微生物药物是微生物的次级代谢产物，是在微生物完成快速生长和某些营养被利用殆尽后才开始产生的。适宜于次级代谢产物合成的发酵条件是菌体细胞生长的限制条件，但次级代谢产物的合成水平又决定于菌体细胞生长状态。在微生物药物生产发酵中如何调整培养基组成是影响药物产量的决定性因素。（1）药物产生菌的营养需求和培养基配制培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、特殊生长因子、水等五大类物质。培养基配制中常用的组分营养性质可用组分碳源糖类：己糖（葡萄糖），戊糖（木糖），双糖（蔗糖、麦芽糖、乳糖），多糖（淀粉、糊精、菊糖、纤维素）醇类：甲醇，乙醇，多元醇羧酸：醋酸，不饱和脂肪酸碳氢化合物：甲烷，正丁烷，石蜡油氮源无机氮源：铵盐，硝酸盐有机氮源：尿素，动植物粉类，玉米浆，酵母和蛋白水解液无机盐磷（KH2PO4），硫（硫酸盐）其他：常量元素和微量元素其他成分前体（苯乙酸→青霉素，应注意对细胞的毒性）促进/诱导剂（硫氰化苄→四环素）消泡剂（植物油脂和动物油脂，聚醚类和硅油类合成消泡剂）酶制剂等在发酵培养基设计中，一般先用合成成分鉴别特殊需要，再转为天然培养基，以扩大生产。在发酵培养基成分选择是，除传统营养外，可选用各种农副产品、工业副产品、废料等。开发天然培养基时，应考虑：新选微生物及其工艺的特殊营养需求；为保持培养基成分稳定，改善储藏条件和加工条件；原料的性质及配制、灭菌、发酵条件对产物提取的影响；培养基价格。（2）影响微生物生长和产物合成的环境因子温度压力和溶氧剪切力pH水活性基质和产物的浓度微生物药物发酵生产不同时期对基质的要求营养生长期生产期碳源容易利用并保持一定浓度缓慢利用的碳源或复合碳源氮源足量的有机氮源，或补充少量无机氮源适量补充无机氮源磷必不可少限制游离磷酸盐微量元素必不可少适量限制前体不需要添加（3）微生物次级代谢产物发酵生产的优化和控制代谢调控碳源阻遏能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用——葡萄糖效应。氮源调控缓效氮源可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢产物的合成；速效氮源能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产物的合成。磷酸盐控制1）促进初级代谢、抑制次级代谢2）阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成3）抑制次级代谢产物合成中某些关键酶的活性4）增加菌体能荷，促进初级代谢自控因子和多效因子产物反馈抑制条件优化过程的三个阶段i.摇瓶发酵ii.小规模发酵实验iii.工艺放大4、药物的发酵技术（1）搅拌式发酵罐（2）补料分批发酵也称半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇的补加有限制性营养物的一种与分批发酵相似的发酵方法。与传统分批发酵相比有以下优点：a)发酵系统维持较低的基质浓度，以除去快速利用基质的阻遏效应；b)维持适当的菌体浓度，不至于加剧供氧矛盾；c)延长次级代谢产物的生产时间；d)避免培养基中积累某些有毒代谢物抑制菌体生长。（3）生产过程及参数控制发酵生产中的常规工艺参数及其检测方法工艺变量符号测量方法生物量X细胞干重，浊度，细胞数底物量S酶法分析-综合法（生物或化学需氧量）产物量P酶法分析或特殊方法氧量O氧电极，气体分析二氧化碳量CCO2电极，气体分析发酵热量HV温度，热平衡5、几种重要抗生素的发酵工艺（1）青霉素的发酵工艺青霉素的产生菌——产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）51-20和点青霉（P.notatum），目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。目前青霉素的发酵单位最高达到60000U/ml。In1928,AlexanderFleming(left),aScottishbacteriologist,discoveredamoldwithbacteria-killingpowerssoincredibleitwaseffectiveevenwhendiluted800times.CourtesyoftheUSDA.Right,astrainofP.notatumwasusedforsomeofthefirsttestsofpencillin.CourtesyoftheFDA’sCenterforDrugEvaluationandResearch.甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的培养基斜面培养砂土孢子生产孢子的制备大米或小米固体培养基上25℃培养7d，孢子成熟后真空干燥，低温保藏备用。大规模发酵生产采用三级发酵，其目的是使青霉菌菌体数量逐步扩大和适应发酵，其次是使发酵罐连续使用，缩短发酵周期。一级发酵：小罐，使孢子萌芽形成菌丝；二级发酵：大量繁殖青霉菌菌丝体；三级发酵：继续大量繁殖菌丝体，生产青霉素。发酵的影响因素及控制碳源、氮源的影响和控制：葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌体的生长；乳糖是青霉素生物合成最好的碳源。青霉素发酵中采用连续流加葡萄糖的方法，在发酵初期使青霉菌大量迅速强壮地繁殖菌丝体；发酵后期利用乳糖使青霉素大量合成。玉米浆是青霉素发酵最好的氮源。前体的影响和控制：苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可以作为青霉素G侧链的前体物直接结合到青霉素分子中，也可以作为养料和能源被利用。苯乙酸、苯乙酰胺等对菌体生长和生物合成均有毒性。采用间歇或连续添加低浓度前体物质的方法，保持前体的供应率仅大于生物合成的需要，可以起到提高产量的作用。pH的影响和控制：青霉素发酵的最适pH一般认为是6.2-6.8，应尽量避免pH超过7.0。当pH高于最适pH时，通过补糖和生理酸性物质（硫酸铵等无机氮源）降低pH；当pH低于最适pH时，通过补加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。可利用自动加入酸或碱的方法维持pH。温度的影响和控制：青霉菌生长的适宜温度是30℃，分泌青霉素的适宜温度是20℃，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。0-56h维持在27.2℃，然后恒速降温至18.7℃，并维持到184h，最后24h回复到27.2℃培养。这样变温培养法可比常温25℃培养产量增加16%。补料控制：中间补糖以控制糖浓度和pH；补加氮源可延长发酵周期、调节pH、提高青霉素产量，控制发酵液中的氨基氮含量在0.01%-0.05%。补加表面活性剂，如新洁尔灭50mg/L、聚氧乙烯、山梨糖醇酐等也能增加青霉素的产量。加入少量可溶性高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮（PVP），能使青霉素产率提高38%。铁离子的影响和控制：Fe3+对青霉素生物合成有显著影响，一般当发酵液中含量超过30-40μg/ml，则发酵单位增长缓慢。铁制发酵罐在使用前必须进行处理，可在罐壁涂上环氧树脂等保护层，使Fe3+含量控制在30μg/ml以下。5、几种重要抗生素的发酵工艺（2）链霉素的发酵工艺链霉素的产生菌——灰色链霉菌（Streptomycesgriseus），比基尼链霉菌（Str.bikiniensis），灰肉链霉菌（Str.griseocarneus）菌种菌种用冷冻干燥法或砂土管法保存，并严格控制有效使用期；所有生产用菌种或斜面都保存于低温冷库内（0-4℃），并限制其使用期限；严格控制生产菌落在斜面上的传代次数，一般以3代为限，用单菌落转种，以使用新鲜斜面为原则；定期进行菌种的纯化筛选，淘汰退化的菌落；不断选育高单位的新菌种。链霉素产生菌容易发生变异大规模发酵生产采用高度通气搅拌、3-4级的扩大深层培养法发酵。菌种（冷冻干燥管）→斜面→摇瓶种子（1-2级）→种子罐种子（1-3级）→大罐发酵（7-8d）发酵的影响因素及控制碳源、氮源的影响和控制：首选碳源是葡萄糖；有机氮源以黄豆饼粉为佳，无机氮源以硫酸铵和尿素最常用，氨水可用来调节发酵pH。无机元素的影响和控制：磷酸盐对菌体生长和链霉素合成非常重要，一般采用较低的磷酸盐浓度，15-150mmol/L（46.5-465mg/L）；Fe2+一般适用量在20μg/ml；生物调节剂A因子——简单的内酯化合物通气和搅拌的影响和控制：增加通气量，保持一定搅拌速度，避免长期停止搅拌和闷罐。温度、pH的影响和控制：链霉素发酵温度以28.5℃为宜；链霉菌菌丝生长的最适pH为6.5-7.0，适于链霉素合成的pH为6.8-7.3。补料控制：补加葡萄糖、硫酸铵和氨水，不仅为菌体生长和产物合成提供营养物质，还能调节发酵液的pH。