甘薯蛋白抗癌作用研究进展

甘薯蛋白抗癌作用研究进展汇报内容立题依据1总结4研究内容和技术路线2研究结果3•我国甘薯（Ipomoeabatatas）产量世界第一（约1亿吨/年），其中约50%用于生产淀粉、粉丝等初级产品，附加值低，加工过程中产生大量废液、废渣。•废液中含1%左右可溶性蛋白，直接排放不仅浪费资源，而且污染水质，亟待解决。•甘薯块根中特有的贮藏蛋白Sporamin占其蛋白总量的60-80%，本实验室前期研究表明，Sporamin能显著抑制人结肠癌HCT-8细胞在裸鼠腹腔内的弥散性生长，并抑制皮下接种的Lewis肺癌细胞在C57黑鼠体内自发性的肺转移。•因此，本课题继续对sporamin的抗癌作用及其细胞内分子作用机制进行了探索。细胞实验：观察甘薯蛋白对3种癌细胞（人结肠癌HT-29细胞、HepG2肝癌细胞、Bcap-37乳腺癌细胞）增殖及转移扩散能力的抑制作用，并探索其相应的细胞内信号转导机制。临床试验：观察甘薯蛋白（SPP）与5-氟尿嘧啶（5-FU）联用治疗人结肠癌的安全性及有效性。•本研究意义在于：–探索甘薯蛋白在防治恶性肿瘤方面的作用和应用价值，为开发新型抗癌药物奠定基础。–提高甘薯加工的利用率和产品附加值。–有助于解决我国甘薯淀粉加工业废水污染环境的问题。–目的：观察甘薯蛋白对3种恶性肿瘤细胞增殖及侵袭转移能力的抑制作用，探索其细胞内分子作用机制。–实验内容：•MTT•结晶紫染色•荧光染色•划痕愈合实验•抗粘附实验•明胶酶谱试验•uPA分泌量测定(ELISA)•免疫印迹•RT-PCR1.细胞培养：从中国科学院细胞库购买各种肿瘤细胞株，按照推荐的方法采用合适的培养基和培养条件在二氧化碳培养箱（37°C，5%CO2）中培养。2.条件培养液（CM）的制备：肿瘤细胞株在培养板中长满后，换成1%小牛血清的培养液并移入可调节氧气浓度的CO2培养箱中继续培养24时，24小时后取出培养板，吸出上清液冻干后备用。3.MTT法细胞生长分析：将肿瘤细胞接种于96孔板（10，000cells/well），加含10%胎牛血清的完全培养基培养24h，然后将培养基换成含有或不含有各种处理试剂的RPMI1640培养基。分别在换液后的1、3、5天测定细胞增殖情况，采用MTT法，加入20μgvital染料MTT（1mg/ml）后继续培养4h，被细胞吸收的蓝色染料用DMSO（100μl/well）溶解，测定其在490nm处的吸光度。正式实验前先做预实验检查吸光度和细胞数量之间是否成正比。3.划痕愈合实验：将细胞按1-5x105个/孔的密度接种于12孔培养板；形成单层细胞后，用20-200微量pipette管尖端刮一个宽1mm的划痕；用新鲜培养基洗两次，然后换成含不同浓度甘薯蛋白的培养基，37℃孵育20h后用PBS冲洗，4％多聚甲醛固定，在刮伤0h和20h后分别照相（放大100倍），用ImageJ图像软件计算刮口的平均距离。细胞愈合划痕的能力用它们的运动距离表示，计算方式如下：（0h时划痕的平均距离-20小时后划痕的平均距离/0h时划痕的平均距离）×100。4.抗粘附试验：将细胞接种到24孔板或6孔板，形成单层细胞后脱血清过夜培养，换含不同浓度甘薯蛋白和PMA的培养基处理24h，然后用PBS冲洗2遍，加入200或500μL0.25%trypsin/0.1mMEDTA，室温，100RPM振荡消化细胞，记录细胞完全脱落需要的时间.5.酶谱法测定MMPs和uPA的活性：分别用明胶酶谱和纤溶酶原-酪蛋白酶谱法测定条件培养基中分泌的MMPs和uPA的活性，用含或不含100ng/mlPMA及不同浓度甘薯蛋白的培养基处理细胞4h，收集培养基，过滤除去悬浮细胞，用浓缩离心管浓缩25-50倍，各组取等量培养基与不含SDS和β-mercaptoethanol的样品缓冲液混合后上样，用含2mg/ml明胶的10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳结束后将凝胶置于复性缓冲液液（2.5%Triton-X100）中震荡洗脱30min×4次；明胶孵育液（50mmol/LTris-HCl、10mmol/LCaCl2、200mmol/LNaCl、1μmol/LZnCl2）37℃孵育24h，考马斯亮蓝染液染色2h，脱色30～40min。分析凝胶图像，应用ImageJ软件读取条带面积和酶解条带灰度，酶含量=条带面积×（条带灰度－背景灰度），以样本酶含量/对照样品酶含量比值表示样本的酶活性值。uPA酶谱做法与MMPs相似，只不过用1mg/ml酪蛋白(MPBiomedicals,Inc.,Irvine,CA)和1U/ml纤溶酶原(MPBiomedicals,Inc.)代替了明胶。5.条件培养基中uPA分泌量的测定：采用ELISA法，根据试剂盒(CusabioBiotech,China)说明书进行测量。6.免疫印迹（WesternBlotting）：用Westernblot法确认各种细胞因子和信号转导分子的表达和激活情况。将处理后的细胞用裂解液（150mMNaCl,1mMEDTA,40mMTris-HCl,pH7.6,1%NP-40,0.1mMPMSF,10μg/mlleupeptin,1μg/mlpepstatin,10μg/mlaprotinin）裂解，BCA法测蛋白含量，样品经SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜上。用含2%t脱脂奶粉的TBS缓冲液（pH7.6）浸泡，4℃过夜封闭非特异性的连接位点。然后加入各种一抗振荡孵育2h，然后在相应的二抗中反应1h，清洗干净后将反应后的条带成像。•逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术半定量分析mRNA表达水平:使用trizol提取细胞中总RNA，A260/280测吸光度测量浓度并评估RNA样品的纯度和完整性，将2微克总RNA反转录成cDNA，然后扩增cDNA，0.5-2.0%琼脂糖凝胶电泳分离细胞DNA，紫外透射仪上观察拍照。引物序列如下：–huManuPA：5’–primer(5’-GGGGGCTCTGTCAC-CTACG-3’)and3’–primer(5’-GGCCCCAGCTCACAATTCCAGTC-3’);–VEGF5’–primer(5’-GGAGGAGGGCAGAATCATCACGAA-3’)and3’–primer(5’-GCCTTGCAACGCGAGTCTGT-3’);–glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH),forward:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,reverse:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′.–MMP–9：sense5′-CATCGTCATCCAGTTTGGTG-3′antisense5′-GGTGTAGAGTCTCTCGCTGG-3′–MMP-2：上游为：5’-TCAGTGCTGGCTGCC1TrAGA-3’，下游为5’-ATGTGGGCTGAGATGCACTG-3’•荧光显微镜观察细胞凋亡（Hoechst33258核染色）：将细胞接种到24孔板上(1.2x105/孔)，托血清16-24h后用不同浓度SPP处理细胞48h，吸去培养基，用PBS洗细胞3次。然后用2.5%的戊二醛固定细胞4h，置摇床上用0.9%NaCL洗细胞3次。除去上清液后，用1μg/mlHoechst33258溶液在冰上避光处理细胞30min，然后用0.9%NaCL漂洗3次，甘油封闭后立即于荧光显微镜下(OlymusIX71)紫外光(360nm)激发，观察细胞核染色情况。结果结果结果结果Fig1.SporamininhibitedthewoundclosureofHT-29cellsinthepresenceofPMA.*,P＜0.05vs.PMAalone;#,P＜0.05vs.vehicle划痕愈合实验Fig3.SporaminsuppressedthePMA-inducedsecretionofuPAinHT-29cellsafter16hFig2.SporamindecreasesadhesionofcolorectalcarcinomaHT-29cellstothesubstrateinthepresenceofPMAinHT-29cellsafter16hFig4.GelatinzymogramofconditionedmediumfromHT-29cancercellstreatedwith100ng/mlPMAandvariousconcentrationsofsporaminduring4-hincubationperiodshowingdirectinhibitoryeffectofsporaminonMMP-9andMMP-2activity.Fig5.uPA,MMP-9andMMP-2geneexpressionisdown-regulatedinhumancolorectalcancers.Fig6.SporamininhibitedPMA-inducedAktphosphorylationtime-dependentlyinHT-29cellsFig7.Hoechst33258nuclearstainingFig8.RT-PCRuPACtrPMA11050uMCtrPMA11050uMCtrPMA11050uMGAPDHCtrPMA11050uMVEGFVEGFFigure8.Schematicpresentationofsporamin-inhibitedsignalingpathwayleadingtosuppressionofcoloncancercellmigrationandinvasion.Figure7.EGFRsignalingpathway.OncetheEFGRtyrosineresiduesarephosphorylated,PI3KistranslocatedtothecellmembraneandbindstotyrosinephosphatewhichtriggersthePI3Kcatalyticsubunitp110toproducePIP.PI3KthenpromotesAKTactivation.p-AKTthenactivatesvarioustargetsthatresultincellgrowth,proliferation,andsurvival.小结甘薯蛋白冲剂的制备:甘薯粗蛋白粉+辅料→用适量乙醇润湿→搅拌制粒→复合膜袋包装→杀菌→备用蛋白含量：6克/袋实验对象入选/排除标准：将10名按TNM分期法属于II期（UICC：T3-T4,N0,M0），刚接受完切除手术，无残留肿瘤组织，无其它严重并发症或恶性疾病，造血功能、肝肾功能正常，尚未开始化疗、放疗或免疫治疗的结肠癌患者。试验分组和剂量：在获得患者签署的书面知情同意书后将其随机配到实验组和对照组，每组5人。实验组采用5-FU加sporamin蛋白冲剂联合治疗，对照组采用安慰剂加5-FU治疗。两组5-FU的剂量均为450mg/m2静脉滴注，甘薯蛋白冲剂的剂量为12g/d（1日2次，1次6g）口服。•监测指标：在实验开始前、后分别检查、测定以下项目：•①症状体征（直肠指检、纤维结肠镜、下腹及腰骶部持续疼痛、肛门失禁、腹水等）；•②血液指标（全血细胞计数、肝功、肾功、血糖、血脂、CEA、trefoilfactor3、growth/differentiationfactor15、溶血磷脂、胰岛素、CA15-3、CA19-9、CA242、p53Ab、和细胞角蛋白cytokeratins）；•③粪便指标（粘液便、血便、隐血、直肠粘液T抗原检测）的变化情况；•④转移情况指标：肝、肺、骨等主要脏器转移情况；•⑤安全性指标：肝功、肾功、不良反应记录等。•⑥自我（主观）感觉指标：患者自我感觉。•结果表1实验对象基本情况n年龄体质指数KPS评分实验组女255.0±1.420.6±0.385.0±7.1男345.3±13.623.8±1.6100.0±0