肝糖原的提取、鉴定与定量实验报告

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4、熟练运用溶液混匀的各种方法。5、正确掌握溶液转移的操作。6、正确操作使用分光光度计。二、实验原理1、肝糖原的提取与鉴定糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。CuSO4十2NaOH=Na2SO4+Cu(OH)2↓2Cu(OH)2十C6H12O6=2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O2CuOH=Cu2O↓(红色)+H2OCu(OH)2=CuO↓(黑色)+H2O2、肝糖原定量测定糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先臵于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。三、材料与方法：以流程图示意1、材料：（1）样品：鸡肝（2）试剂：95%乙醇、5%（W/V）三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L（50%）NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L（30%）KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）、蒽酮显色剂（3）仪器和器材：普通离心机、室温-100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管（2ml、5ml）、1000μl微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板2、方法：（1）肝糖原的提取与鉴定（2）肝糖原定量测定鸡肝约1g，剪碎+5%CCl3COOH1ml研磨至乳状+5%CCl3COOH3ml研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心3min（4000r/min）上清液（取2ml）离心5min（4000r/min）+2ml95%乙醇，混匀，静置10min沉淀上清液（弃去）白瓷板孔穴中糖原溶液1ml糖原水解液2滴+班氏试剂4滴沸水浴2min，观察变化沉淀（弃去）沸水浴2min，溶解沉淀加碘试剂2滴糖原溶液2滴加碘试剂2滴呈色对比+浓HCL5滴沸水浴15min，冷却+50%NaOH5滴糖原水解液混匀四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。1、结果：（1）实验现象：1）肝糖原的提取与鉴定第一次离心后，肝匀浆分为2层，上层为上清液，不完全澄清，下层为淡褐色沉淀。取鸡肝0.15g于试管中沸水浴15min取3支试管，分别标记为空白管、标准管、样品管往三支试管中分别加入0.2%蒽酮溶液2.5ml，混匀+30%KOH1.5ml（用吸量管）冷却，全部转入100ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液往空白管中加入蒸馏水1.0ml，标准管中加入标准葡萄糖溶液1.0ml，样品管中加入糖原提取液1.0ml沸水浴10min，冷却在分光光度计620mm波长处，用空白管溶液调零，测定并记录各管溶液的吸光度（A）图1肝匀浆图2肝匀浆第一次离心后加入乙醇混匀并静置后，溶液分层，上层为上清液，下层有白色絮状沉淀。第二次离心后，溶液分为2层，上层为上清液，试管底部有少量白色沉淀。图3第二次离心后的白色沉淀④加入蒸馏水并沸水浴后，白色沉淀溶解。⑤白瓷板上，糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，与碘自身的黄色有明显区别。图4呈色对比结果（左为糖原溶液加碘试剂，右为碘试剂）碘试剂2滴糖原溶液2滴碘试剂2滴⑥往糖原水解液中加入班氏试剂后，溶液呈蓝色（班氏试剂本身为蓝色）。沸水浴后，溶液变为砖红色（生成砖红色沉淀）。图5糖原水解液图6沸水浴前图7沸水浴后2）肝糖原定量测定往鸡肝中加入KOH并沸水浴后，溶液变为红棕色。图8沸水浴后，溶液变为红棕色水浴前，空白管呈黄色，标准管呈绿色，样品管呈黄色（颜色比空白管浅）。水浴后，空白管无明显变化，标准管颜色略变深，样品管由黄色变为深绿色（颜色比标准管深）。砖红色沉淀图9水浴前图10水浴后（2）实验数据：测定次数标准管样品管10.5930.40120.5930.39730.5940.396平均值0.5930.398表1标准管和样品管测得的吸光度（A620）及平均值按下式计算样品中肝糖原的含量：肝糖原（g/100g肝组织）=A样品*0.05*100*100*1.11A标准肝组织重（g）1000由于样品稀释了一倍，因此计算结果需乘二。结果：肝糖原的含量为4.966g/100g肝组织。故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝组织，且肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。2、讨论：（1）实验数据分析：本次实验测得肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。查书得饱食鸡肝肝糖原含量为2~3g/100g肝组织。本次实验结果偏大，说明肝组织中含有过多肝糖原，试验所用鸡肝为脂肪肝。空白管标准管样品管空白管标准管样品管（2）呈色对比结果分析：糖原溶液与碘试剂反应呈红棕色，与碘试剂本身的黄色区别明显，说明糖原含量较大。（3）糖原水解液与班氏试剂反应结果分析：该反应主要是通过检测葡萄糖与班氏试剂的还原性糖反应间接鉴定溶液中糖原的存在。糖原溶液被浓盐酸水解为葡萄糖，葡萄糖中的醛基可被Cu(OH)2氧化为羧基，即把葡萄糖氧化为葡萄糖酸，Cu2+则被还原生成Cu2O砖红色沉淀。因此水浴后，溶液由蓝色变为砖红色，实验现象明显。（4）注意事项：1）蒽酮试剂为浓硫酸所配制，使用时应小心谨慎。若不慎沾到皮肤上，应立即用大量清水冲洗。2）离心后，用移液枪吸取上清液时应避免枪头触及沉淀，否则会使沉淀物上浮，导致上清液浑浊。避免将枪头伸到液面下再按按钮，否则枪头喷出的气泡也会激起沉淀物。3）打开室温-100℃恒温水浴箱盖子时要小心水蒸气，以免烫伤。4）使用离心机时要注意配平，否则会损坏离心机。5）使用分光光度计时不得在仪器界面上转移试剂，以免腐蚀分光光度计。6）肝糖原提取中，往上清液加入95%乙醇时要充分混匀。溶液总量较大，混匀操作不易，可用倾倒混匀或用玻璃棒搅拌混匀。7）肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则影响比色。8）蒽酮试剂必须2倍于被测液。