3种植物花螺原体的分离及其基本特性-生物谷-生物医药门户

ResearchPaper研究报告微生物学报ActaMicrobiologicaSinica48(9)：1141~1146;4September2008基金项目:南京农业大学引进人才基金项目(804052)作者简介:于汉寿(1964),男,江苏人,博士,副教授,研究方向为微生物资源与分子生态。Tel/Fax:[phone];E-mail:[e-mail]收稿日期:2008-03-25;修回日期:2008-05-25ISSN0001-6209;CN11-1995/Q种植物花螺原体的分离及其基本特性于汉寿，阮康勤，纪燕玲，陈永萱，王志伟(南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，南京210095)摘要：【目的】调查我国植物花上的螺原体的存在，搜集我国的螺原体资源，并研究它们的基本生物学特性。【方法】常规螺原体分离、培养方法，应用暗视野显微镜和透射电子显微镜观察螺原体形态，根据16SrDNA和ITS序列构建系统发育树研究螺原体分离菌株可能的分类地位。【结果】分别从油菜(Brassicanapus)、杜鹃(Rhododendronsimsii)、红花酢浆草(Oxaliscorymbosa)3种植物花表分离到4株螺原体CNR-1和CNR-2、CNA-1、CRW-1，对其形态、部分生理生化特性及分子生物学特性进行了初步研究。这4株螺原体在R-2液体培养基中生长良好，都能通过孔径为0.22m的微孔滤膜；在R-2固体培养基上呈圆形或颗粒状菌落，菌落直径约50~600m；在生长的某个阶段可呈典型的螺旋状，菌体直径为37.04~370.40nm，长度约0.89~11.88m；它们都能利用葡萄糖作为碳源，不能利用尿素；在不含胎牛血清的R-2培养基中，它们都不能生长；菌株CNR-1、CNA-1能强烈代谢精氨酸，而CNR-2和CRW-1不能代谢精氨酸；在氨苄青霉素钠浓度高达2000U/mL的R-2培养基中，分离菌株生长良好。根据16SrDNA序列构建的系统发育树显示，分离菌株CNR-1和CNR-2、CNA-1与蜜蜂螺原体Spiroplasmamelliferum聚类较近，而CRW-1与S.clarkii聚类较近；根据ITS序列构建的系统发育树显示，CRW-1形成一个单独的分枝，其它3个菌株仍与S.melliferum聚类。【结论】以上结果初步表明，分离菌株CNR-1和CNR-2、CNA-1极有可能是Spiroplasmamelliferum，而CRW-1可能是一个新的螺原体种，但还需要血清学试验进一步验证。关键词：螺原体；生物学特性；油菜；杜鹃；红花酢浆草中图分类号：Q939.34文献标识码：A文章编号：0001-6209(2008)09-1141-06螺原体(Spiroplasma)是硬壁菌门(Firmicutes)柔膜菌纲(Mollicutes)的一类螺旋状、无细胞壁的原核生物，它们基因组小（0.78~2.22Mb），是能独立生活和自我复制的最简单的原核微生物[1]。作为一类重要的微生物资源，由于其形态结构和营养代谢的特点，螺原体常作为研究生物膜和运动的模式生物受到关注[2,3]。绝大多数螺原体分离自昆虫和扁虱，在几种植物体内或花表也分离到螺原体[4]。有些螺原体对宿主有致病性，如螺原体Spiroplasmaapis和S.melliferum导致蜜蜂（Apisspp.）“五月病”（Maydisease）和“爬蜂病”，S.citri，S.kunkelii和S.phoneiceum分别引起柑橘顽固病(Citrusstubborn)、玉米矮缩病(Cornstunt)1142HanshouYuetal./ActaMicrobiologicaSinica(2008)48(9)和紫苑黄化病(Asteryellow)，而大多数螺原体和宿主之间是共生(Mutualism)或互生(Commensalism)关系[4]。有许多研究证实花上螺原体与昆虫之间有密切的关系，Clark认为蜜蜂螺原体在蜜蜂体内出现和消失的时间与植物开花时间一致表明花可以作为传播中间体[5]，这种推测得到Davis等的支持，后来大量植物花螺原体的发现进一步支持了这种观点[6]。目前一般观点认为，花上螺原体可能是携带螺原体的昆虫在取食花蜜或花粉时留下的,花仅是作为定居场所在昆虫传播中起作用，这种推测也被食叶昆虫及非虫媒花上没有发现类似的螺原体所支持[4]。但是，直接从植物花分离得到的螺原体从哪里来？在自然界中如何传播？螺原体是否在植物花上增殖？是否进入植物体内？是否对植物产生什么影响？这些问题目前尚不清楚。国际上已有36个螺原体有效种的记录，但国内有关螺原体的研究极少[7,8]。为获得我国的螺原体资源，并为以后进一步研究螺原体与宿主之间的相互关系，2005年3~7月间，我们从江苏省南京市东郊采集了大量的植物花分离得到4株螺原体，并研究了其基本生物学特性。1材料和方法1.1材料1.1.1供试植物花和螺原体菌株：用于分离螺原体的植物花有油菜(Brassicanapus)、杜鹃(Rhododendronsimsii)、红花酢浆草(Oxaliscorymbosa)、牡丹(Paeonasuffruticosa)、现代月季(Rosahybrida)、虞美人(Papaverrhoeas)、诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)、唐菖蒲(Gladiolushybridus)等80多种，都是在华东地区于3~7月间开花的植物。用镊子随机采集盛开的花盛放于干净的保鲜袋中，3~5朵花为一个样品，避免用手直接接触样品，扎紧样品袋口后带到室内立即进行分离。1.1.2主要试剂和仪器:DNA提取和纯化、PCR扩增所用酶和试剂同文献[9]。Chelex-100树脂和牛心冻干粉(PPLO)购自Sigma公司；所用暗视野显微镜为OlympusBH-2，透射电子显微镜为HitachiH7650。1.2螺原体的分离及纯化分离所用培养基是由C-3G简化后的R-2培养基[7]。在无菌的平皿中加入5mL左右的R-2培养基，将样品用无菌镊子取出，将花瓣分离后浸泡于培养基中，并轻轻转动2~5min后，将浸泡过花瓣的培养基用孔径为0.45m的微孔滤膜过滤，滤液收集于无菌的1.5mL离心管中，于30℃静置培养；逐日观察培养基颜色变化，并用暗视野显微镜(OlympusBH-2)观察验证，持续观察一个月。分离菌株的纯化用梯度稀释法[8]。1.3分离物的滤过性及对青霉素的抗性取1mL培养物用孔径0.22m的滤膜加压过滤，在暗视野显微镜下检查是否有菌体存在。在R-2培养基中加入不同单位的氨苄青霉素钠以检查螺原体对青霉素的抗性[7]。1.4螺原体的形态及运动性观察应用负染法在电子显微镜下观察分离菌株的形态[7]。取0.5mL处于不同生长期的螺原体培养液，用等体积4％戊二醛（内含0.03mol/L磷酸缓冲液，pH7.3~7.5）固定，于4℃静置1~3d，吸一滴固定后的液体置于铜网上，静置2min，用滤纸吸干溶液，用1.5%的磷钨酸钠溶液(pH7.0)染色40s，再用滤纸吸干，风干后用透射电子显微镜(HitachiH7650)观察其形态。用暗视野显微镜观察分离菌株的运动性[7]。1.5螺原体的培养及其生理学特性将分离物接种到R-2液体或固体培养基中，30℃静置培养，逐日观察培养基颜色变化，并用暗视野显微镜观察分离物的密度和运动方式。用倒置显微镜观察分离物在R-2固体培养基中的菌落形态。在研究分离菌株对葡萄糖、精氨酸及尿素时，分别用1％的葡萄糖或精氨酸、或0.2%的尿素替代R-2培养基中的蔗糖，然后接种20μL对数生长期的菌体，在30℃静置培养；在研究螺原体生长对血清需求中，取20L对数生长期的菌体接种于不含胎牛血清的R-2培养基[7]。30℃静置培养，连续转管培养3于汉寿等：3种植物花螺原体的分离及其基本特性./微生物学报(2008)48(9)1143次以上；逐日观察培养基颜色变化，并用暗视野显微镜观察验证。以接种R-2培养基作对照，重复3次。1.6螺原体的16SrDNA和ITS分析用Chelex-100树脂法提取螺原体的总DNA[8]，利用PCR技术以螺原体总DNA为模板扩增其16SrDNA[10]，所用通用引物为27F(5′-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACCTTGTTACGA-CTT-3′)。扩增ITS序列所用引物为ITS-F(5′-CCCC-TTATGTCTTGGGCTAC-3′)和ITS-R(5′-CTATCTC-CAGGTTCGATTGG-3′)，扩增片断为16SrDNA序列全长和ITS序列(其中包括16SrDNA及23SrDNA部分序列、16S~23SrDNA间隔区)。用凝胶回收试剂盒(Axygen公司)对扩增到的片段进行回收，将回收产物酶连到pMD19-T载体上,转化至E.coliDH5α，通过蓝白斑挑选转化子，经过培养后提取质粒，酶切验证插入片段大小，测序由Invitrogen公司完成。利用BLAST将测序结果在NCBI()中与相关的16SrDNA序列进行同源性分析。下载与菌株16SrDNA同源并经过菌种鉴定的序列，用ClustalX1.8进行多重序列对比，然后用MEGA4.0采用邻接法生成系统发育树，以亲缘关系较近的Mycoplasmahominis作为外群。2结果和分析2.1植物花螺原体分离物的获得从采集到的80多种植物花进行螺原体的分离，结果从油菜(Brassicanapus)、杜鹃(Rhododendronsimsii)、红花酢浆草(Oxaliscorymbosa)3种植物花上分离到4个来源不同的分离物，分离物用梯度稀释法纯化3次。获得分离物的花外表与正常花无明显差异。分离物CNR-1和CNR-2分离自油菜花，CNA-1和CRW-1分别分离自杜鹃花和红花酢浆草的花表。2.2植物花螺原体分离物的滤过性、对青霉素的抗性及其它基本特征分离菌株CNR-1、CNR-2和CNA-1在R-2液体培养基中生长繁殖速度较快，30℃静置培养2d培养基就变色，而CRW-1生长相对较慢，培养4～5d培养基才变色。用暗视野显微镜观察到上述4种分离物的菌体螺旋状，在液体培养基中可作翻滚式运动。都能通过孔径为0.22m的微孔滤膜。在氨苄青霉素钠浓度高达2000U/mL的R-2培养基中，分离菌株能正常繁殖，生长良好。以上结果说明这些分离物为螺原体。将分离菌株接种到R-2固体培养基中，30℃培养2d（CNR-1、CNR-2和CNA-1）或4d（CRW-1）后用倒置显微镜观察到菌落呈圆形或颗粒状，菌落直径在50~600m之间变化，形态没有明显差别。菌落大小与琼脂浓度、接种量密切相关。琼脂浓度低、接种量少则菌落相对较大。在电镜下4个菌株均可见丝状螺旋形菌体，其中，CNR-1、CNR-2和CNA-1菌株的菌体直径在0.18m左右，一般有5~8个螺旋，CRW-1菌体直径约0.20m，多数有5~6个螺旋，菌体中间或末段可见膨大部分(图1)。图1用负染法在电镜下观察4株植物花螺原体分离菌株的形态(标尺为500nm)Fig.1Electronmicrographofnegative-stainedpreparationsoffourspiroplasmaisolates.1144HanshouYuetal./ActaMicrobiologicaSinica(2008)48(9)A:CNR-1;B:CNR-2;C:CNA-1;D:CRW-1.scalebars:500nm.2.3分离菌株的生理特性在不含胎牛血清的R-2培养基中，分离菌株都不能生长，说明上述植物花螺原体分离物依赖血清中的甾醇生长。分离菌株都能利用葡萄糖作为碳源，而不能利用尿素。在以精氨酸为唯一碳源的R-2培养基中，接种和培养CNR-1、CNA-12-4d后培养基由红色逐渐变成黄色，培养液仍然