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85号楼413工作室1第一章1.1何谓生化分离技术的集成化概念？请举例加以说明。1)利用已有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成);2)或把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标；例子⑴多种分离、纯化技术相结合，包括新、老技术的相互渗透与融合，形成所谓融合技术；⑵生化分离技术（下游技术）与发酵工艺（上游技术）相结合或称耦合，形成系统工程；1.2说明生化分离的主要步骤并指出胞内产物和胞外产物的分离纯化流程不同之处①材料及处理来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少②目的物的提取将目的物从材料中以溶解状态释放出来，方法与存在部位及状态有关③分离纯化核心操作，须据目的物的理化性质，生物性质及具体条件定④浓缩，结晶，干燥⑤保存整个过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（收率、纯度）（胞内外的区别就是在于破壁）2.1简要说明常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。①胞捣碎法，原理：机械运动产生剪切力适用于动植物组织②高速匀浆法，破碎程度较上法好，且机械剪切力对生物大分子的破坏较小，处理量大。原理：利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于突然的减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。适用于：较柔软、易分散的组织细胞。③研磨法和珠磨法适用于微生物与植物细胞④挤压瓶适用于细菌（G-）⑤超声破碎⑦物理法（反复冻融动物材料、渗透压冲击细胞壁脆弱的微生物、急冷骤热（细菌病毒等热不敏感的物质））⑧干燥法（热空气干燥法适用于酵母，真空干燥法适用于细菌，冷冻干燥法适用于不稳定的酶）⑨化学法，1、溶剂处理法丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂可溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。2、表面活性剂法添加如十二烷基磺酸钠、去氧胆酸钠等，通过破坏细胞膜而破碎细胞，释放目的物。此法常需与其它方法结合应用⑩酶解法，1．自溶法，将欲破碎细胞在一定条件（pH、T）下保温一定时间，通过细胞本身存在的酶系的作用，将细胞破坏，使胞内物质释放。2．外加酶法利用各种水解酶专一性地将细胞壁分解，使内含物释放出来。细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA）酵母：采用β-葡聚糖酶霉菌：添加几丁质酶植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。发展方向：㈠多种破碎方法相结合㈡与上游过程相结合㈢与下游过程相结合(如:利用金黄色葡萄球菌,发酵生产A蛋白。通常A蛋白结合于菌体胞壁上,需要进行细胞破碎,然后将A蛋白从胞壁上剪切下来,过程繁琐,难度大。若用生物技术培养出A蛋白分泌型菌来生产,A蛋白的分离纯化就容易得多.)2.2、简述盐析分级范围的选择依据？某纯酶和粗酶的盐析分级范围是否相同？为什么？可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得P8，回收率和纯度考虑。纯酶的分级范围比粗酶宽一些，因为纯酶的纯度比较高一些，在采用盐析时更注重回收率，可以适当加宽分级范围，而粗酶由于杂志较多则注重纯化倍数。2.3、从植物或动物材料中提取酶类，一般预处理过程中影响酶收率的原因是什么？如何解决?植物组织被破坏时，酶和酚类处混合接触状态，很易发生反应。产物苯醌和单宁酸类会继续和酶蛋白反应,使目的酶失去活性。为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行的步骤。预处理注意事项⑴温度尽可能低；⑵提取液的量要保证“充分浸入”；⑶加入足量酚类吸附剂；（天然清蛋白，合成聚丙乙烯）⑷加入足量氧化酶抑制剂；2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，又是醌的清除剂；⑸搅拌转速要恰当；⑹pH要控制在合适范围，一般5.5～72.4、分离技术的主要种类：细胞破碎(celldisruption)沉淀分离(precipitation膜过滤(membranefiltration)层析分离(chromatography)电泳分离(electrophoresis)离心分离（centrifugation）1形状和大小：凝胶过滤、超滤、透析⑵电离性质离交色谱、电泳（除SDS）⑶极性（疏水性）分配、吸附、疏水色谱⑷生物功能或特殊化学85号楼413工作室2基团亲和色谱⑸等电点pI色谱聚焦、电聚焦⑹溶解性盐析、有机溶剂提取、结晶⑺密度、大小超离心SDS-凝胶电泳2.5怎样选择细胞破碎的方法？总原则：最大提取、不易变性、减少干扰具体须从材料特性和目的物特性综合考虑。1．材料细胞的特性动物细胞易破碎，只需用温和方法植物细胞较难破碎，须用中等或强度大的方法，微生物细胞较复杂，一般用较强方法2.目的物的特性⑴细胞中的位置游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。结合状：可能结合在膜或细胞器内需先收集膜或细胞器，再破碎⑵敏感性温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响⑶处理量有些处理量大，如组织捣碎机、匀浆器等。有些处理量少，如超声波破碎等。3.1膜分离1、何谓“浓度极化”现象，怎样避免膜过滤中的“浓度极化”现象？浓差极化concentrationpolarization：指外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，而大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度的现象。是指在超滤过程中，由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。在反渗透过程中，由于水不断地透过膜，引起膜表面附近的溶液浓度升高，从而在膜的高压一侧溶液中，从膜表面到主体溶液之间形成一个浓度梯度，引起溶质从浓的部分向淡的部分扩散，这一现象即为浓差极化。(1)增高流速首先可以采用化工上溶胀的增加骚动的措施。也就是说设法加大流体流过膜面的线速度，其中也包括采用层流薄层流道法。(2)填料法如将29---100UM的小球放入被处理的流体中，令其共同流经反渗透器以减小膜边界层的厚度而增大透过速度。小球的材质可用玻璃或甲基丙烯酸甲酯制作。此外，对管形反渗透器来说，也可向进料中微形海绵球，不过，对板式和卷式组件而言，加填料的方法是不适宜的。主要是因有将流道堵塞的危险。(3)装设油液促进器所谓湍流促进器一般是指可强化流态的多种障碍物，例如对管式组件而言，内部可安装螺旋挡板，对板式或卷式的膜组件可内衬网栅等物以促进湍流，实验表明，这些湍流促进器的效果很好。(4)脉冲法主要作法是在流程中增高一脉冲发生装置，使液流在脉冲条件下通过膜分离装置，脉冲的振幅和频率不同，其效果也不一样。对流速而言，振幅越大或频率不同，其净利要也不一样，对流速而言，振幅越大或频率越高，透过速度也越大，虽然动力增加了25---50%，但是，换来了透过速度提高了70%的得益，有相当经济价值。(5)搅拌法是目前应用广泛，特别是在测试装置中必定使用的一种方法。其主要作法是在膜面附近增高搅拌器，也可以和在磁力搅拌器上回转使用，试验表明，传质系数与搅拌器的转数成直线关系。(6)加分散阻垢剂为防止反渗透膜结垢，某厂过去曾以加硫酸或盐酸调节PH值，但因酸系统的腐蚀和泄漏使操作者很感麻烦，现在改用一种PTP-0100的高效阻垢分散剂可免去加酸的麻烦，并使系统运行正常。3.2、简述微滤膜的主要种类，特点和主要分离机理。种类据材质分成：1）有机微滤膜，具韧性，适应性强，制备简单，易成形，工艺较成熟。常用聚乙烯、聚偏氟乙烯和聚四氟乙烯等聚烯烃类聚合物组成。2）无机微滤膜，无机陶瓷膜具备化学稳定性好、机械强度大、抗污染能力强、耐高温、孔径分布窄、可高压反冲洗、再生能力强、分离效率高、不易老化等优点。3）复合微滤膜，复合微滤膜充分利用了有机与无机微滤膜的各自优点。复合微滤膜的制备包括三种形式1）将一层微滤膜的薄膜和常规过滤介质利用层压技术复合在一起；2）通过不同的工艺手段实现有机与无机的黏合改性；3）将微滤膜技术与生物处理法相结合的新型复合式膜生物反应器(IMBR)分离机理(1)筛分，膜将尺寸大于孔径的颗粒截留。(2)吸附，膜将尺寸小于孔径的颗粒吸附截留。(3)架桥，固体颗粒在膜微孔入口处因架桥而被截留。(4)网络，截留发生在膜内部，因膜孔的曲折而形成。(5)静电，分离悬浮液带电颗粒时，可采用带相反电荷的微滤膜。能用孔径比待分离的颗粒尺寸大许多的微滤膜，不仅可达到较好的分离效果，还可获较高通量。3.3、膜选择和使用时考虑的主要参数是什么？影响流率的主要因素是什么？不管微滤、超滤还是纳滤，选择时，一般应注意以下指标。⒈截留分子量---指截流率达90%以上85号楼413工作室3的最小被截留物质的分子量。（以球形分子测）*一般选用的膜的额定截留值应稍低于所分离或浓缩的溶质分子量。2.流动速率---指在一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量。(ml/cm2.min)。其它还有操作温度、化学耐受性、膜的吸附性能、膜的无菌处理等等。影响流率的因素：⒈溶质的分子性质，比重大的纤维分子扩散性差，比重较小的球形分子易扩散⒉溶质浓度：一定压力下，稀比浓流率高；⒊压力：不同溶质应选择不同的操作压力；⒋搅拌：加快扩散，减少浓度极化，提高流率；*对切力敏感的大分子（酶、核酸）须控制搅拌速度;⒌温度：升温能提高流率（不同溶质区别对待）;⒍其它：如溶液pH、离子强度及溶剂因素等对流率均有影响3.4、从原理上比较超滤和纳滤两种膜过滤技术，简要说明它们的主要差别。超滤：以特殊超滤膜为分离介质，以膜两侧的压差为推动力，将不同分子量物质选择性分离。最小截留分子量500道尔顿用途：⑴大分子物质的脱盐和浓缩；⑵小分子物质的纯化；⑶大分子物质的分级分离；⑷生化制剂或其它制剂去热原处理纳滤技术纳滤是介于超滤与反渗透之间的膜分离技术，其截留分子量在200-1000的范围内，孔径为几纳米。截留小分子有机物同时透析出盐，集浓缩与透析一体；在保证一定膜通量的情况下，纳滤所需压力比反渗透低的多，可节约动力.3.5、超滤的工作模式有哪几种，各种工作模式的主要特点是什么。超滤的工作模式有——浓缩（在浓缩悬浮粒子或大分子过程中，产物被膜系统截留在料液罐中）、透析（在悬浮粒子或者大分子透析过滤中产物被膜截留住，低分子量溶质盐蔗糖醇则通过摸）和纯化（采用这一工作模式纯化溶剂和低分子量溶质，他们被回收在透过液流中，可是在截留的物质中也可能同样含有感兴趣的产物）层析总论4.1、层析分离技术的类型主要有哪些？何谓分辨率？层析技术的分类：㈠据固定相基质的形式分类可分为纸层析、薄层层析和柱层析。㈡据流动相的形式分类可分为液相层析和气相层析。㈢据分离的原理不同分类可分为吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、反相层析、亲和层析等。分辨率是相邻两个峰的分开程度，用相邻两峰的保留时间之差比上两个半峰宽之和表示。4.2、常用吸附剂的种类及特点？吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。常用吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、羟基磷灰石等。1）硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。2）氧化铝氧化铝对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想；用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和含有的碱性杂质，并可使颗粒表面带有阴离子，具离子交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝。3）活性炭是使用较多的一种非极性吸附剂。一般选用颗粒活性炭，主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。4）羟基磷灰石HA机理的主要观点是：HA的Ca基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，对生物分子的分离起重要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，则起次要作用。4.3、羟基磷灰石分离活性物质的主要机理是什么（上面）？核酸在HA层析柱上分离的次序是单链RNA、杂链RNA、双链DNA，为什么？DNA与羟基磷灰石的相互作用基于DNA磷酸酯骨架与羟基磷灰石中的钙离子间的作用。洗脱时用磷酸缓冲液，核酸分子的亲和性受其分子中磷酸集团