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生化实验总结第小组制作成员：‘实验内容实验回顾实验总结实验收获实验内容实验内容移液管和微量可调式移液器的使用、校正与误差分析一血清碱性磷酸酶活性测定三五血清葡萄糖浓度的测定（GOD-POD法）七质粒DNA的提取九721E分光光度计的原理与操作联系二血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离四酶的竞争性抑制六血清GPT活性测定八DNA琼脂糖凝胶电泳十血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳5实验二：721E分光光度计的原理与操作联系•该实验要求掌握721E分光光度计的原理、结构与操作方法，以及学习末知溶液的浓度测定方法，并通过实验制作CuSO4标准曲线，求得未知CuSO4溶液的浓度。•了解Lambert-Beer定律：吸光度（Absorbance）吸光系数液层厚度溶液浓度A=kLC实验一：移液管和微量可调式移液器的使用、校正与误差分析•该实验主要练习使用刻度移液管、微量可调式移液器，以及对测量数据进行准确度和精确度的评估，计算量具容量的校正值、实验三：血清碱性磷酸酶活性测定碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。在PH=10的环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠苯酚，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚胺衍生物，测定红色物质的吸光度就可以计算酶活力的大小。磷酸苯二钠+H2O苯酚+磷酸氢二钠苯酚+4-氨基安替比林红色醌亚胺衍生物ALPpH=10铁氰化钾实验四：血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离•凝层层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝层颗粒，颗粒内部具有三维多孔网状结构。在洗脱过程中，混合物样品流经层析柱，大颗粒物质因其直径大于凝层网孔，不能进入凝层颗粒内部，只能沿着凝层颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先流出层析柱；小颗粒组分由于其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝层颗粒内部，流程长而移动速度慢，比大分子物质后流出层析柱，分子大小不同的混合物因此得到分离。实验五：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳•血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组成、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH=8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。9实验六：酶的竞争性抑制•竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。•草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在体内，琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后与氧结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色）作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H而被还原为甲烯白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。实验七：血清葡萄糖浓度的测定（GOD-POD法）•葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放出过氧化氢。后者在过氧化物酶（peroxidase，POD）的作用下与色原性氧受体4-氨基安替比林偶联酚缩合成红色醌类化合物，即Trinder反应。该红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。•酶法测定血清葡萄糖是以过氧化物酶的偶联酶反应定量法葡萄糖+O₂+H₂O→葡萄糖酸+2H₂O₂2H₂O₂+4-氨基安替比林+苯酚→红色醌类化合物实验八：血清GPT活性测定•α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合生成相应的苯腙，在碱性条件下显色。两种苯腙的吸收光谱有差异，在250nm比色时，丙酮酸-2,4-二硝基苯腙的光密度值远较α-酮氏二酸苯腙高。反应30min后，α-酮氏二酸量减少而丙酮酸量增加，在一定范围内，520nm处光密度增加的程度与反应体系中丙酮酸和α-酮氏二酸的摩尔比例呈线性关系。丙氨酸+α—酮戊二酸谷氨酸+丙酮酸丙氨酸+2,4-二硝基苯肼丙酮酸-2,4-二硝基苯腙+H₂OGTPOH-12实验九：质粒DNA的提取•在含有SDS的碱性条件下，细菌细胞壁破裂，释放出来的染色体DNA,质粒DNA和蛋白质等都发生变性。当加入酸性的醋酸钾溶液将PH中和至中性时，质粒DNA为共价闭合环状结构，很快复性并溶解在溶液中。而染色体DNA由于相对分子量大难以复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，然后用酚/氯仿抽提进一步除去少量残留的蛋白质，最后用乙醇沉淀获得质粒DNA.实验十：DNA琼脂糖凝胶电泳•在pH8.0~8.3时，核酸分子的碱基几乎不解离，磷酸基团解离。核酸分子带负点，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，分子大小和构象不同的核酸分子的迁移率呈现较大差异，从而达到分离核酸片段并检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料如EB后，在紫外灯可观察到不同核酸片段的区带。实验回顾1.在以往的多次实验中，我们小组各个成员分工明确，非常积极，保证实验成功完成2.当轮到我们组做PPT时，大家也都用心准备，充满热情3.试验后大家会认真思考老师留下的问题，并且认真对待每一次的实验报告优点1.在实验中缺少自己的想法，只是照着书上或PPT上的步骤来做，有时候只想着快点做而不是想想自己做的这一步的有什么作用和意义。2.在做PPT是只是做了大致的内容，并没有按老师建议的针对某个问题做出研究，没有达到预习和做PPT原本的的3.每次实验还不够认真，有时会在一些细节上抱着消极的态度缺点实验总结以及建议1.我们所做的这些实验，大部分都会接触一些新的器材，了解了一些以前未见过的的器材，并掌握了它们的用法，同时也回顾了一些以前用过的仪器，消除了一些本来存在的对一些仪器的恐惧感2.了解了每次实验用的各种试剂的原理、作用机制，以及它们在各个步骤加入时的作用3.实验的内容都是书上我们学过的内容，通过实验我们巩固了书上的知识4.每次实验的成功完成都是小组成员一起努力的结果，并不是某一两个人所能完成的5.每次实验都逐渐增强了我们的实际操作能力实验收获SAYING每次试验都会有我们理论课学习的内容，通过这些实验我们进一步掌握书上有关的内容，进而复习书上的内容THANKYOU