血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定-实验报告

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称(TitleofExperimetn)血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定实验日期(DateofExperiment)2013-12-11实验地点(LabNo.)合作者(Partner)指导老师(Instructor)总分(TotalScore)教师签名(Signature)批改日期(Date)【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液醋酸铵缓冲溶液20%磺基水杨酸1%BaCl2溶液氨基黑染色液漂洗液pH8.6巴比妥缓冲溶液电泳仪、电泳槽实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）实验步骤：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min磺基水杨酸检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质BaCl2检测SO42-阴性BaCl2检测SO42-阴性（二）离子交换层析（纯化）：沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12滴继续用2ml0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤用2-3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12滴继续用2ml0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤用2-3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡除盐后收集的球蛋白过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm）用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约1ml开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线+点样区（粗面）收集含有蛋白质的洗脱液每管10滴，连续收集3管DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）除盐后收集的清蛋白过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm）用1ml0.0６mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,用约５mL0.06mol/LNH4AC缓冲液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白收集含有清蛋白的洗脱液每管10滴，连续收集2管DEAE-纤维素柱先用6mll.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用10ml0.02mol/LNH4AC缓冲液流洗再生平衡2管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)2cm点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。取出膜，用滤纸吸干即可。注意事项：1、所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。2、使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。3、上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。4、洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。5、切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。6、葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生,避免损耗，严禁倒掉!1.5cm【实验报告第二部分（实验记录）：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；③原始实验数据。评分（满分20分）：XX】主要实验条件：1、0.3mol/LpH6.5醋酸铵（NH4AC）缓冲液：称取NH4AC23.12g，加蒸馏水800ml溶解，滴入稀氨水或稀醋酸液（注意混合均匀），调节pH至6.5后，补加蒸馏水至1000ml。2、0.06mol/LpH6.5NH4AC缓冲液：取上液用蒸馏水做5倍稀释。3、0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液：取上液用蒸馏水做3倍稀释。4、1.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液：称取NaCl87.7g溶于0.3mol/LpH6.5NH4AC溶液中至1000ml。5、饱和硫酸铵溶液：称取固体(NH4)2SO4850g加入1000ml蒸馏水中，在70-80℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸溶液。实验现象：饱和硫酸铵加入到血清后有沉淀生成，沉淀呈米黄色，上清液呈淡黄色。原始实验数据：将3条经染色的醋酸纤维素薄膜并列，使点样线位于同一水平，以正常血清蛋白图谱为对照，观察提纯的物质属哪种蛋白。所得的照片如下图：血清清蛋白、γ-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱【实验报告第三部分（结果与讨论）：①结果（定量实验包括计算）：应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果；②讨论：不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。③结论：简单扼要，说明本次实验所获得的结果。（包括思考题）。评分（满分45分）：XX】结果：从电泳图谱中可以看出，清蛋白第一管和清蛋白第二管的蛋白质与血清的清蛋白电泳图谱几乎一致，可以确定管内的蛋白质为清蛋白，同理球蛋白管内的蛋白质为γ-球蛋白。讨论：清蛋白第1、2管均含有少量杂质，γ-球蛋白管中的γ-球蛋白纯度较低，导致最终的电泳图谱与血清的电泳图谱有略微偏差。结论：本次试验所获得的结果基本与预期试验结果相一致。思考题：1.硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?答：因为清蛋白和球蛋白的盐析浓度不一样，使用半饱和硫酸铵溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。2.为什么实验中DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白?答：因为缓冲液都一样并且分离球蛋白后DEAE纤维素柱的成分没有发生改变，可以继续用于纯化清蛋白。3.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么?答：根据各自的电泳图谱与正常血清蛋白图谱作对照来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白。判定它们纯度的依据是染色后颜色的深浅，深的说明纯度高，浅的说明纯度低。