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第二讲培养基目的要求：一、掌握培养基的种类及其特点三、掌握培养基的组成和其适宜剂量二、掌握MS培养基配制四、理解培养基筛选方法第一节培养基的种类和成分一、培养基种类▼二、培养基成分▼第二节培养基制备▼一、母液配制和保存二、培养基配制、分装和灭菌▼第三节培养基的选择▼一、单因子试验二、多因子试验三、逐步增减法四、广谱实验法一、培养基的种类1、根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。固体培养基是指加凝固剂的培养基。培养基中加入一定量的凝固剂，加热溶解后，分别装入常用的培养容器中冷却后即得到固体培养基。液体培养基是指不加凝固剂的培养基。培养基种类固体培养基液体培养基▲营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长发育不整齐。二者比较2、根据培养物的培养过程培养基分为：初代培养基和继代培养基外植体：从植物体上取出的用于无菌培养的植物材料。植物材料：茎尖、茎段、花瓣、叶子、花药等•初代培养：指用来第一次接种从植物体上分离下来的外植体过程。继代培养：对培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，就称为继代培养。3、根据其作用不同，培养基分为：诱导培养基增殖培养基生根培养基4、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。常用培养基种类MS培养基B5培养基White培养基N6培养基KM-8P培养基★•有机成分复杂，它包括了所有的单糖和维生素•用于原生质体培养(包括原生质融合的培养)KM-8P培养基特点：N6培养基特点：•1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计•成分简单•KNO3和(NH4)2SO4含量高•广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养等White培养基特点：•1943年由Ｗhite为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作Ｗhite改良培养基。•特点：无机盐含量较低•适用：生根培养。B5培养基特点：•含较低的铵•双子叶植物尤其木本植物组培可选择MS培养基特点：无机盐、离子浓度高，硝酸盐含量较高。▲MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培生长所需的矿物质营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡二、培养基成分水植物激素无机盐有机物培养体支持材料辅助性物质▲一、无机盐▲氮枝叶生长需要氮素，缺氮老叶先发黄；氮过量，枝叶过度茂盛。磷缺磷，植株生长缓慢，老叶暗紫色。钾促进花卉生长健壮，增强抗性，茎秆挺拔。缺钾，叶尖、叶缘枯焦，叶片呈皱曲状，老叶发黄或火烧状。钴缺钴，叶片失绿而卷曲，整个叶片向上弯曲凋枯。二、有机物维生素肌醇氨基酸天然复合物椰子汁（CM）酵母浸出液（YE)水解酪蛋白（CH)碳水化合物马铃薯汁液其它▲碳水化合物•选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等•蔗糖浓度：2%～3%，胚培养为4%～15%•大生产时可用白糖▲糖在培养基的作用：1）为细胞提供合成新物质的碳骨架2）为细胞的呼吸代谢提供底物和能量3）维持渗透压种类：VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、VB3（烟酸）、Vc（抗坏血酸浓度：0.1－1.0mg/L作用：VB1促愈伤组织产生，提高活力VB6促根生长Vc防组织褐变VB3与植物代谢和胚的发育有关系维生素▲氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同，其种类和浓度不同。肌醇：又称环己六醇，在糖类的转化中起作用名称分子量溶解性质性质蔗糖342.30溶于水、乙醇无变旋现象山梨糖180.16溶于水甜味与蔗糖相似葡萄糖180.16溶于水有变旋现象，以游离态或磷酯形式存在果糖180.16溶于水、乙醇有变旋现象，甜度高于蔗糖盐酸硫胺素（VB1）337.28溶于水、乙醇、甘油受高温影响小，可高温消毒核黄素（VB2）376.37溶于无水乙醇、微溶于水等电点PH=6.0，碱性溶液中易变质，光能加速变质盐酸吡哆素（VB6）205.64溶于水、乙醇对光、空气、热稳定是转氨酶的辅酶钴胺素（VB12）1355.42溶于水、乙醇受高温影响小，可高温消毒，参与丝氨酸转变为甘氨酸过程烟酸（VPP）123.11极易溶于水、乙醇对空气、光、热、PH值稳定生物素（VH）244.31溶于水、乙醇对空气温度稳定叶酸（VM）441.40易溶于乙酸、NaOH、微溶于水参与生物甲基化作用抗坏血酸（VC）176.12极易溶于水有较强的还原能力，可做抗氧化剂用，参与酪氨酸代谢及色氨酸的羟基化作用肌醇180.16易溶于水植物中广泛存在，可能与IAA的代谢有关常见糖和维生素及其主要性质椰乳：促愈伤组织和细胞培养，用量10－20%，使用注意茎尖大小香蕉泥：用量150－200ml/L，应用在兰花组培马铃薯汁液：用量150－200g/L，使苗壮水解酪蛋白：浓度100－200mg/L，应用在微茎尖培养天然复合物▲自然界中，植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、生长、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许多生理生化活动。在培养基中，其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素。激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽的分化，胚状体的形成等。通常，不同植物，或不同品种，甚至同一植物的不同位置对激素的要求有很大的变化，这主要取决于植物的内源激素水平。组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4－D）三、激素（一）、激素的种类：1、生长素类：在自然界中，生长素影响茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织）组织培养中常用的生长素：1二氯苯氧乙酸（2，4－D）2萘乙酸（NAA）3吲哚乙酸（IAA）4吲哚－－3－丁酸（IBA）NAA、IAA、IBA被广泛用于生根，2，4－D有利于愈伤组织的诱导和生长。IAA容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。溶解方法：1MNaOH或95％酒精，以前者为好保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存2、细胞分裂素自然界中，细胞分裂素影响细胞分裂，顶端优势的变化和茎的分化等组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。常用的细胞分裂素有：6－苄氨基嘌呤（6－BA）激动素（6-糠氨基嘌呤、KT）玉米素（ZT）噻二唑苯基脲（thidiazuron、TDZ）溶解方法：1MHCL保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存3、赤霉素由日本人黑泽1926年发现。自然界中，赤霉素能够打破休眠、促进果实成长等效果。虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。虽然也有赤霉素能刺激不定胚发育成正常小植株的报道，但在使用中仍需慎重，不可轻易添加。赤霉素有20多种，其中在组织培养中最常用的是GA3。在组织培养中与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素不太常用，据报道赤霉素能刺激不定胚正常发育成小植株溶解方法：95％酒精保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解灭菌：高温易分解，要过滤灭菌4、脱落酸在自然界中，脱落酸能阻碍发育、促进老化、形成休眠芽等作用。经试验表明，脱落酸有利于胚性愈伤组织形成正常不定芽。材料的试管保存，加上脱落酸能抑制生长，使继代培养时间延长。溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。保存：具有热稳定性，但容易发生光解。配成一定浓度后，冰箱冷藏保存（二）、常见培养基中植物激素配方类型激素配方再生方式及用途1.无植物激素诱导生根、无性胚、愈伤组织形成2.单加生长素诱导生根、愈伤组织、无性胚、不定芽3.单加细胞分裂素诱导不定芽、侧芽增殖、愈伤组织形成4.高生长素低细胞分裂素诱导芽、原球茎增殖、愈伤组织形成5.低生长素高细胞分裂素诱导丛芽、愈伤组织形成6.低生长素低细胞分裂素诱导不定芽、侧芽增殖7.等量生长素与细胞分裂素诱导侧芽增殖8.加生长抑制剂（多效唑、矮壮素等）壮苗、延缓生长、利于试管苗保存9.加GA3打破种子、芽休眠，促进伸长生长名称分子量溶解性质主要作用吲哚乙酸（IAA）175.19易溶于热水、乙醇、乙醚、丙酮促进细胞的延伸生长和细胞壁结构的松驰，也可用于诱导生根吲哚丁酸(IBA)203.24溶于醇、丙酮、醚稀碱、稀酸液为生根刺激剂a-萘乙酸(NAA)186.20易溶于热水、丙酮、醚、乙酸、稀碱液促进细胞生长，刺激生根2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)221.04易溶于醇、丙酮、乙醇、稀碱液促进愈伤组织形成赤霉酸(GA3)346.38易溶于醇、乙酸乙酯、碳酸氢钠和醋酸钠的水溶液，其钠促进茎、叶伸长生长，打破休眠（三）、常见生长调节剂及主要性能一览表（四）、常见生长调节剂的微摩尔/升浓度与毫克/升的换微摩尔/升毫克/升IAAIBANAA2,4-DKTBA2iPZTTDZGA310.1750.20320.18620.22100.21520.22530.20270.21900.22020.346420.35040.40640.37240.44210.43040.45050.40540.43800.44040.692730.52550.60940.55860.66310.64560.67580.60810.65700.66061.039140.70070.81280.74480.88420.86080.90100.81080.87600.88081.385550.87591.01600.93101.10521.07611.12631.01351.09501.10101.731961.05111.21921.11721.32621.29131.35161.21621.31401.32122.078271.22631.42241.30341.54731.50651.57681.41891.53301.54142.424681.40141.62561.48961.76831.72171.80211.62161.75201.76162.771091.57661.82881.67581.98941.93692.02731.82431.97101.98183.1173四、培养体支持材料•1.琼脂•用量7－10g/L（0.7%-1%）注意：1若浓度过高，培养基就会变得很硬，营养物质就难于扩散到培养的组织中。2当进行营养需要研究时，应注意不要使用琼脂，因为市场供应所有琼脂含有杂质，特别是含有Ca,Mg和微量元素。•2.其它卡拉胶、玻璃纤维、滤纸桥、海绵等▲五、辅助性物质•1.抗生素•2.抗氧化物•3.活性炭▲抗生素1.常用种类：青霉素链霉素庆大霉素等2.用量：5%－20%3.作用：防止由外植体内生菌造成的污染。4过滤灭菌▲抗氧化物常用抗氧化剂及使用：半胱氨酸VC（50－200mg/L液洗涤外植体伤口表面）。活性炭1.作用：具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度0.1－0.2%）；促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度0.3%）。利于胚胎培养。2.常用浓度：0.5－10g/L3.活性炭的作用①对生长的抑制：其吸附了植物激素②对生长的刺激：其吸附了有抑制作用的物质▲第二节培养基配制一、母液配制与保存二、培养基配制(一)母液配制流程图称量母液分装确定培养基溶解定容贴标签保存于冰箱一、母液配制(以MS为例)称量药品•天平预置•全显示•清零•称药•(二)母液配制要求：•1.母液浓缩倍数：10-100，大量元素10；微量元素、铁盐100；有机物50；•2.选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂•3.防止沉