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雪上一枝蒿提取物对人肝癌细胞株HepG2的生长抑制作用研究答辩人：苏琴诗班级：07级药学学号：07113004指导老师：黄先菊目录第一部分：前言第二部分：实验方法第三部分：实验结果第四部分：讨论与结论第五部分：参考文献前言肿瘤的发病机制及治疗现状雪上一枝蒿的药用作用概述实验材料及细胞系雪上一枝蒿根块购自安徽亳州，采用系统溶剂分离法提取分离，其醇提物及各个有效部位均为本实验组提供。人肝癌细胞株HepG2购自武汉大学典藏物保存中心。雪上一枝蒿五个提取部位分别为：氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，正己烷，水溶。实验方法肿瘤细胞的培养MTT显色法测细胞活性流式细胞仪测细胞凋亡Hochest33258染色法测细胞凋亡肿瘤细胞的培养培养基：PRMI-1640，10%胎牛血清，青霉素，链霉素培养箱：37℃，100%相对湿度，5%CO2MTT显色法测细胞活性实验原理：四甲基偶氮唑盐(MTT)能被活细胞线粒体还原成蓝紫色的甲躜结晶物，而死细胞和红细胞则无这种能力，甲躜可溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，呈蓝色溶液，它的颜色可与活细胞数成正比，所以根据OD值来反映存活细胞的变化，从而推算出肿瘤细胞在化疗药中的存活率和抑制率。实验方法细胞消化，点板。加药加MTT反应加DMSO显色酶标仪测OD值数据处理流式细胞仪测细胞凋亡实验原理：实验操作：流式细胞仪检测雪上一枝蒿五个有效部位的细胞凋亡情况Hoechest33258荧光染色法实验原理：Hochest33258染料可以直接和细胞内的DNA结合，在荧光显微镜下发出蓝色荧光。凋亡细胞由于染色质固缩，细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。实验操作：用Hoechest33258检验雪上一枝蒿五个提取部位对HepG2的凋亡的影响。实验结果MTT显色法测细胞活性IC₅₀（μg/ml）：2831.605药物种类IC₅₀（μg/ml）正己烷部位74.1677氯仿部位37.986乙酸乙酯部位112.8488正丁醇部位183.0931水溶部位1413.471雪上一枝蒿氯仿不同提取副部位的细胞毒作用分析药物名称IC₅₀（μg/ml）氯仿12-15158.0855氯仿16-1851.6175氯仿19-2085.3039氯仿30-3461.6277药物名称IC₅₀（μg/ml）正己烷10-1343.0031正己烷14-1656.3051正己烷17-18259.1714正己烷19-2180.4979正己烷29-33128.9659药物名称IC₅₀（μg/ml）乙酸乙酯16-18200.1244乙酸乙酯19-2098.8020流式细胞仪检测结果由图可知，经过雪上一枝蒿各个提取部位（200μg/ml）处理24小时后，除水溶部位，正丁醇提取部位外，肝癌细胞中坏死细胞，早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞都有不同程度的增加，说明这几个部位能诱导细胞产生凋亡。荧光显微镜结果图1：对照组图2：氯仿提取部位图3：乙酸乙酯提取部位图4：正丁醇提取部位图5：水溶部位图6：正己烷提取部位讨论本研究为抗肿瘤药物的相关筛选，经采用MTT法，流式细胞仪，荧光显微镜对雪上一枝蒿的水、氯仿、正己烷、乙酸乙酯和正丁醇的萃取部位进行体外抗肿瘤活性研究表明，雪上一支蒿提取物的上述各萃取部位对HepG2有不同程度的抑制作用，在给药后24h有明显效果。氯仿部位对HepG2的最大抑制率为74.43%，正己烷部位最大抑制率为67.86%，两个部位的半数抑制率分别为37.986%和74.1677%，说明氯仿部位和正丁醇部位具有明显的体外抗肿瘤活性，且有明显的剂量依赖性，这可能是氯仿部位生物碱含量较高。对其相关提取副部的研究显示，两个部位的副提取部位对肿瘤细胞也有一定的抗癌作用，还可以近一步研究其体内抗癌的相关药理作用。正丁醇部位和水溶部位作用较差，有可能是药物难以在溶解在这两种溶剂中。因此，雪上一枝蒿的各提取部位的化学成分和抗癌药理作用还需进一步研究。参考文献[1]张秋菊，杨晶，杨凤娟，刘美娜.肝癌的健康生命年损失研究.中国卫生经济，2010年3月，第29卷第3期:34～36.[2]韩东铁.雪上一枝蒿的化学成分与药理作用研究概况.延边大学医学学报，2007年9月，第30卷第3期:223～224.[3]符华林.我国乌头属药用植物的研究概况.中药材，2004年2月,第27卷第2期:149～152[4]杨梅芳，陈建芬.雪上一枝蒿药材基原及性状特征检索.云南中医中药杂志，2008年，第29卷第5期:33～34[5]钱平利.37种二萜化合物抗肿瘤作用的初步研究.第二军医大学硕士学位论文.2006年5月.[6]罗静.IL-24对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响.中南大学硕士学位论文.2007年5月.[7]刘小月.四十种植物体外抗肿瘤活性筛选及加拿大一枝黄花活性成分研究.浙江大学硕士学位论文.2006年6月.[8]鲍丽娟.四种石斛抗肿瘤活性的研究.合肥工业大学硕士学位论文.2007年12月.[9]沈立明,兰子尧,刘琼,倪嘉缵.柠檬酸镧诱导肿瘤细胞凋亡的研究.中国稀土学报，2009年6月,第27卷第3期：441～445.[10]张诚明，李根林，范尔钟.复方中药制剂诱导成纤维细胞凋亡的实验研究.眼科研究,2008年1月第26卷第1期:22～25.[11]晏芳,李建栋,俞守义,聂军.白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡中线粒体形态功能改变.实用医学杂志，2009年，第25卷第12期：1947～1950.[12]安晓丽,赵敏,董露璐,何平平,相文华.斜生褐孔菌多糖诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的研究.菌物学报，2009年11月，28(6):819-824[13]胡盛,陈世敏,杨光忠,梅之南.赤参水提物对人肝癌细胞株HepG2细胞的影响.华中师范大学学报(自然科学版),2007年3月,第41卷第1期:91～94.[14]牛凤兰,李晨旭,王学东，程舸，梁睿，董卿，王天行.菱灵颗粒有效成分的抗肿瘤作用研究.食品科学，2006年，卷27，第9期:253～256.[15]解美娜,李锋杰.无花果枝提取物体外诱导胃癌BGC_823细胞凋亡的研究.天然产物研究与开发,2010年，22卷:219～222.[16]陈建坤,陈超,刘朝奇.海洋珍珠生物提取液对人宫颈癌Caski细胞增殖与凋亡作用的影响.安徽农业科学,2010年，38（26)：14215—14217．14219.[17]贺艳杰,黄宇贤,李玉华,宋朝阳,郭坤元.中华眼镜蛇毒组分诱导人急性髓系白血病细胞株KGla细胞凋亡的研究.实用医学杂志，2010年第26卷第13期：2277～2280.[18]阎博民,于红,尹延梅,张文卿,吕锐.慢病毒介导的siRNA联合紫杉醇抑制胃癌细胞增殖的研究.现代生物医学进展,2010年5月，第10卷第09期：1676～1679.[19]韩雪莲,方志杰,陈军浩,高军峰,马春艳,殷晓进.合成芪类化合物抑制肿瘤细胞增殖并诱导Bel_7402细胞凋亡.中国生物化学与分子生物学报,2007年11月,23(11):963～970.[20]郑杰刘艳平宗永立李忠魁苏文曾建国.红车轴草提取物对胃癌BGC_823细胞凋亡的影响.生命科学研究，2006年7月，第10卷第6期：178～182.[21]郑重飞.圆齿紫金牛化学成分及生物活性研究.中国协和医科大学硕士学位论文.2006年7月.致谢感谢黄先菊老师的指导与教诲！感谢任炜学姐的关心和帮助！感谢答辩组的所有老师与同学！