8-1药物的抗菌试验

辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学第8章药物制剂的微生物学检查1.掌握药物的体外试菌试验方法（琼脂扩散法和系列稀释法），了解药物的体内抗菌实验。2.掌握一般灭菌制剂的无菌检查方法和原理，熟悉特殊药品的无菌检查法。3.掌握非灭菌药物的微生物总数测定方法，熟悉药品的大肠杆菌检查方法。4.了解一般药品的沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和破伤风杆菌的检查方法。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学第1节药物的抗菌试验药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或杀菌药物的抑菌试验；测定药物杀菌活性的杀菌试验；以及检查两种药物联合作用的联合抗菌试验等。一般抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微生物，抑菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生长。杀菌药物能杀死微生物，杀菌药物除去后，微生物仍然不能生长。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条件下相对而言的。在我们检测时，药物的作用受到用药时培养基的组成、温度、PH值及所用的菌种、菌量等各个因素有关。虽然说体外抗菌试验有很多优点，但是由于体外抗菌试验没有复杂的体内因素影响，因此药物体外抗菌试验和体内抗菌试验可能会出现不一致的结果。所以，一般我们在体外对药物进行测试后，有效的药再要进行体内试验，如果体内试验再次证实此药有效的话，才能推荐应用到临床。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学第一节药物的体外抑菌试验一、药物的体外抑菌试验（一）体外抑菌试验药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。稀释法稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用μg∕ml或U/ml表示。具体的液体培养基连续稀释法见书本（P138图8-1），固体培养基连续稀释法，又可分为平板法和斜面法。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学2.2.琼脂扩散法利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长的原理进行的。一般用于细菌和酵母菌的药敏试验。1.滤纸片法（纸碟法）滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时。然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。如果是β－内酰胺类抗生素还要放在-20℃保存。这就制成了干燥的含药液的纸片。一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断，比如：抗生素或化疗药物抑菌圈直径（mm）耐药中敏敏感氯霉素≤1213-17≥18红霉素≤1314-17≥18四环素≤1415-18≥19卡那霉素≤1314-17≥18辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学1.打洞法在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔，4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品，放在37℃，12-18小时，测定其抑菌圈直径。所以说微量法适于药物血浓度的监测。优点是微量（血清用量少）敏感，操作简便。除此之外还有管碟法、直接滴加法和挖沟法：适用于测试一种药物对几种细菌的抗菌作用。方法是先制备普通琼脂平板，并在平板上挖直沟，在沟内滴加药液，在沟侧接种细菌。经过培养以后观察家细菌生长的情况。我们可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学一）、体外杀菌试验杀菌试验是用来评价药物对微生物的致死活性的。1.最低杀菌浓度（MBC）（最小致死浓度MLC）的测定按液体培养基稀释法的操作方法测了药物的MIC。然后把未长出菌的各个试管培养液分别移种到无菌平板上，培养后凡是平板上无菌生长的药物最低浓度就是最小致死浓度（MLC）。如果是细菌的话可以称为最小杀菌浓度（MBC）。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学1.活菌计数法将定量的试验菌加入到一定浓度的定量药物中，作用一定时间后，取样进行活菌数计数，从存活的微生物数量计算出药物对试验菌的致死率，从而判断药物的杀菌能力。活菌计数一般是将定量的药物与试验菌作用后混合液稀释后，混入琼脂培养基做成平板，培养后数平板上形成的菌落数，由于一个菌落是由一个细菌繁殖而来的，所以可以用菌数乘以稀释倍数，计算出混合液中存活的细菌数。或者也可以用微孔滤膜过滤药物与试验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放在平板上培养后数菌落数。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学1.酚系数测定（石炭酸系数测定）酚系数是以酚为标准，将待测的化学消毒剂与杀菌效力相比较，所得的就是杀菌效力的比值。由于各种化学消毒剂杀菌原理各不相同，因而这种方法仅仅适用于酚类消毒剂杀菌效力的测定。具体的测定方法说是分别将酚及待测化学消毒剂按不同比例稀释，各取5ml放到试管中，再加入经24小时培养后的菌悬液各0.5ml，混匀后放入20℃水浴中，5、10、15分钟分别取一接种环混合液移种到另一支5ml的肉汤培养基中，37℃培养24小时记录生长情况。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学（三）、联合抗菌试验联合抗菌试验主要用于测定两种抗菌药物联合应用时的相互影响。两种抗菌药联合应用时抗菌作用加强的称为协同作用；抗菌作用减弱的称为拮抗作用；相互无影响的称为无关。常用的联合抗菌试验的方法有以下几种。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学联合药物敏感试验和杀菌试验意义目的在于：①治疗混合性感染；②预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生；③联合用药可以减少剂量以避免达到毒性剂量；④联合用药比单一用药时效果更好。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学出现4种结果：①无关作用小，两种药物联合作用的活性等于其单独活性；②桔抗作用，两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性；③累加作用，两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和；④协同作用，两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学1.棋盘格法棋盘稀释法是常用的定量方法，首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的MIC。药物最高浓度为MIC的2倍，对倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。接种菌量为5×105CUF／ml，35℃孵育18h后观察结果。计算部分抑菌浓度（FIC）指数。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学FIC指数0．5为协同作用；0．5－1为相加作用；1～2为无关作用；＞2为拮抗作用。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学[棋盘法的设计]棋盘法的主要优点在于甲、乙两药的每个药物浓度都有单独的和与另一个药物不同浓度的联合，因此能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。在进行棋盘法之前应先测定两种抗菌药物单独对受试菌的MIC，然后以两药MIC的8倍、4倍、2倍、1倍以及MIC的1/2、1/4、1/8浓度（或4倍、2倍、1倍、1/2、1/4浓度）分别进行联合。可见举例，如表—1的青霉素G与链霉素联合药敏实验和表2的TMP+SMZ的联合作用。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学药物及浓度青霉素G(IU／m1)链霉素单药对照4210.50.25链霉素（µg／ml）64------32------16------8---+++4---+++青霉素G单药对照---++细菌对照-：无细菌生长+：有细菌生长FIC指数=1／1+16／16=2——无关辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学2.纸条试验在含菌平板上垂直放两条浸有不同药液的滤纸条，培养后观察两药形成的抑菌区的图形来判断两药联合应用时，是无关、协同还是拮抗作用。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学3.纸条梯度平板试验将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜放凝固后制成斜面培养基。将平皿放平加入含抗菌药物的琼脂培养基，这样在制成的双层琼脂平板中含有梯度浓度的抗菌药物。要求其最小抑菌浓度的位置约处于平板的一半。然后将试验菌液均匀涂布在平板表面。取纸条浸透另一待检药液，按梯度中药物浓度递减的方向置于平板表面，培养后观察形成的抑菌区的图形以判断两种药物之间的相互作用。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学二、药物的体内抗菌试验药物的体内抗菌试验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。如血液及组织内的蛋白质或磷脂、脓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。机体内的微生物，代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有时还可形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。机体内各组织中药物的吸收，分布不同，使药物的浓度难以恒定。因此在评定新药的药效时除做体外抗菌试验外还需要做体内的抗菌试验。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学三、影响抗菌试验的因素1.菌种在抗菌试验中所用到的菌种，必需是国家卫生部生物制品检定所菌各保藏中心专门提供的标准菌株。在特殊情况下，也可以采用临床新分离的并经过鉴定、纯化及合理保藏的菌株。而且我们要用到的试验菌种应该选择是对数期生长的菌。因为那时菌种生命力最旺盛，这对于我试验测定的结果也会准确些。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学1.培养基试验所有到的培养基应按各试验菌的营养要求进行配制，严格控制各种原料、成分的质量及培养基的配制过程。要注意当有些药物具有抗代谢作用时，培养应不能存在代谢物，否则抑菌作用将会被消除。培养基内如果含有血清等蛋白质时，有可能与某些抗菌药物结合，使抗菌药物失去，所以就要避免培养基混进这类营养物。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学1.抗菌药物药物的物理状态、浓度、稀释方法等都会直接影响抗菌试验的结果，必需精确配制。如果是固体药物，必需使药物溶解或使药物呈均匀悬液。PH值应调至中性，以确保药物的稳定性和不影响细菌的生长。中草药因为有颜色和含有鞣质，结果的判断，应特别注意。2.对照试验为确保试验结果的科学性和准确性，试验时应同时进行各种对照试验。试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。溶剂及稀释液对照：配制抗菌药物时所用的溶剂及稀释液均应无抗菌作用。已知药物对照：应使已知抗菌药物对标准菌株出现抗菌效应。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学复习题：1.药物体外抑菌试验常用的方法有哪几种？具体的试验操作方法？2.如何测定药物的最小致死浓度？3.联合抗菌试验常用的方法有哪些？4.药物体内抗菌试验的方法？5.抗菌试验的影响因素有哪些？辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学实验细菌对药物敏感性的实验（药敏片扩散法）目的意义：掌握药敏片扩散法进行药敏实验的一般方法体会药敏实验在临床用药上的指导意义基本原理：药敏片是含有抗生素的滤纸片，将其置于涂满待测菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内扩散，抑制细菌生长，从而出现抑菌环。根据抑菌环的大小可以判定细胞对此药物的敏感度。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学器材及试剂:药敏片：含各种抗生素的市售产品培养基平板：普通牛肉膏蛋白胨固体培养基，待检细菌的培养物。眼科镊、无菌棉拭子、酒精灯等。辽阳职业技术学院制药微生物微生物与药学实验步骤:1、用无菌棉拭子沾取小量待测菌液，均匀涂布平板，待稍干后，用无菌眼科镊将各种药敏片分别平贴在平板培养基表面，每板4-6个，相互间应有一定距离（15mm）。2、置37℃，培养8-12h，观察结果。3、结果判定：观察有无抑菌圈及测量其直径，按下表判定对药物的敏感性。辽阳职业技术学院制药微