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2011-11-111制药生物技术Biotechnologyforpharmaceuticsproduction浙江工业大学生物工程研究所InstituteofBioengineering,ZhejiangUniversityofTechnology●1微生物制药●2新型发酵技术制药●3生物转化与药物合成●4转基因制药当代生物制药的技术●4转基因制药●5抗体工程制药●66细胞培养技术制药●77海洋生物制药●88其他其他一、认识抗原抗体一、认识抗原抗体抗原抗体反应抗体攻击病毒抗抗SARSSARS的的单单抗抗SARSSARS--CoVCoV2011-11-112抗体是一种蛋白质(Immunoglobulin)抗体由四条蛋白质长短链所组成（两长两短）抗体分子上有两个抗原结合区（二者相同）抗体与抗原结合是专一性的（lock&key）抗体结合区抗体与抗体结合犹如互补的积木抗原抗原抗体抗体抗体与其抗原间的专一性吸引力都还是由二级键所贡献抗抗体体是是对对其抗原有其抗原有极强专极强专一性的一性的魔魔弹弹或巡弋或巡弋飞弹飞弹研研究究以以免免疫疫转转印法印法检测检测特定抗原特定抗原医医疗疗以毒素以毒素连结连结抗体攻抗体攻击击病病变变細胞細胞检检验验以以免疫酶检测技术免疫酶检测技术((ELISAELISA))检测检测特定特定病原体病原体抗体药物销售趋势图抗体药物销售趋势图2011-11-113●●至至20002000年底，在美国药品市场上生物技术药物年底，在美国药品市场上生物技术药物有有7676种，其中抗体药物有种，其中抗体药物有1515种。种。●●20032003年治疗用单抗销售总额已超过年治疗用单抗销售总额已超过5252亿美元。亿美元。●●20062006年年5050--6060个治疗性单抗上市。个治疗性单抗上市。年单抗销售额年单抗销售额亿美亿美●●20102010年单抗销售额年单抗销售额200200亿美元。亿美元。●●美国已占全球单抗市场美国已占全球单抗市场90%90%——一支独秀。一支独秀。●●完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段Epitope,AntigenicdeterminantEpitope,Antigenicdeterminant抗原决定基抗原决定基●●一一个个抗原分子上可能抗原分子上可能有数个抗原决定基有数个抗原决定基●●每个抗原决定基至少诱生一种专一性抗体●●蛋白质性抗原决定基含有蛋白质性抗原决定基含有六六个个以上以上氨氨基酸基酸抗体的种类第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)整体水平抗体生成技术整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术细胞工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术嵌合抗体、改形抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术组合抗体库技术噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术IgIg基因转基因小鼠基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体真核表达技术二、二、多克隆抗体、、多克隆抗体2011-11-114多克隆抗体（多克隆抗体（polyclonalantibodypolyclonalantibody））给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物,,它是由多种抗原决定簇刺激多株它是由多种抗原决定簇刺激多株BB细胞增殖分化所产生的细胞增殖分化所产生的,,称为多克称为多克隆抗体隆抗体..如如::免疫血清（含多种特异性抗体）。免疫血清（含多种特异性抗体）。实际意义：实际意义：（（11）预防、治疗感染性疾病，）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清如：破伤风抗毒素血清ÆÆ抗抗破伤风，破伤风，胎盘球蛋胎盘球蛋白白ÆÆ抗病毒感染抗病毒感染等等副作用：副作用：ÆÆ超敏反应超敏反应缺点：特异性差。缺点：特异性差。抗原免疫1234BALB/c1234脾脾脏脏淋巴结淋巴结BB细胞细胞传统抗血清所有抗体混合1234传统传统抗血清的交叉反抗血清的交叉反应应专一性反应专一性反应没有反应没有反应交叉反应交叉反应1122332222++--??123123AgAAgAxyzxyzAgBAgB11’’2020AgAAgA’’三、三、单克隆抗体B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤技术的基本原理骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体可生产有用抗体的淋巴细胞若与癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。癌细胞可培养生长融合瘤YYYYYYYYY细胞浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYY胞融合两组染色体混在一起也可以培养生长产生专一性抗体一个Bcell只产生一种抗体2011-11-115抗原注入小鼠体内骨髓瘤细胞分离B淋巴细胞细胞融合杂交瘤细胞能产生抗体能无限增殖既能产生细胞培养选择培养细胞注入小鼠体内培养培养基体外培养从腹水提取从培养液提取单克隆抗体增殖既能产生抗体又能无限增殖杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术原理：聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体X-a-b-c-d抗原决定基BALB/cabbcd脾脏产生各种B细胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫抗原抗原通常有多个抗原决定基免疫后约在两月內注射五到八次AgX抗体-a-b-c-d传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和采血后可得传统抗血清由脾脏收集B细胞免疫后的脾脏细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微免疫小鼠动物：7～12周龄20g～25g体重首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫矿物油(石蜡油)、乳化剂(羊毛脂)和灭活的分枝杆菌(结核分枝杆菌或卡介苗)组成的油包水乳化佐剂脾脏为B细胞的集中地取出脾脏细胞取出脾脏细胞2011-11-116免疫后取出脾脏淋巴细胞。培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中免疫脾细胞的制备：1×108的淋巴细胞无菌手术细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)融合方法50%PEG1min内加完;2min内加10ml培养液加入化学试剂促进细胞融合2011-11-117融合细胞的早期培养10～20天出现克隆HAT筛选挑克隆HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNAHAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻在这一方法中，一个亲本骨髓瘤细胞株为次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶缺陷型(HGPRT-)；另一个亲本淋巴细胞株为胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-),在含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶核苷（T）的HAT选择培养液中上述亲本细胞都无法生存，只有融合以后的杂种细胞才能生长，因此可以有效地选择出杂种细胞。HAT的选择作用淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转化酶），将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力2011-11-118B细胞与骨髓瘤细胞融合96孔细胞培养盒96孔细胞培养盒刚融合完成一个癌细胞与两个脾细胞经过数次分裂稳定的细胞群落细胞稳定后扩大至T-25细胞瓶在T-75小瓶中扩大细胞数目经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失单克隆抗体的制备外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。单克隆抗体的产生动物体内诱生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只体外培养法：中空纤维培养系统单抗含量不高，牛血清Ab难以去除2011-11-119前5天进行,预先腹腔注射pristane高滴度腹水前5天进行,预先腹腔注射pristane（1～5）×106细胞1～3w形成腹水腹腔注射法盐析沉淀亲和层析离子交换层析McAb的纯化单克隆抗体的特性高度特异性（一）单克隆抗体的特性高度特异性高度的均一性和可重复性弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法单克隆抗体的优点与局限性体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高McAbPcAb抗原要求可以不纯纯度高得量高低McAb与PcAb的比较特异性高低稳定低高沉淀反应无有成本高低2011-11-1110单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用一、检验医学诊断试剂病原体测定：肝炎病毒－肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH－弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒，单纯疱疹病毒肿瘤抗原的检测：二、蛋白质的提纯单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。三、疾病的治疗在体内免疫治疗中的应用抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内运输和药代动力学小结杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。四、四、基因工程抗体2011-11-1111基因工程抗体制备基因工程抗体制备基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新