原位杂交技术

李成仁组织胚胎学教研室Tel：752220，Email：[e-mail]第四章原位杂交技术形态学实验技术中心法则免疫组织化学？核酸分子原位杂交一、核酸分子原位杂交的基本概念(一)定义用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交,从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。简称原位杂交(二)基本原理碱基互补配对原理加热变性杂交反应酶标记的抗探针标记物的抗体酶显色反应带标记物的探针定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。(三)DNA变性(denaturation)本质是双链间氢键的断裂解链曲线热变性变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，双链DNA变性一半所需要的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度,Tm)。其大小与G+C含量成正比。熔解温度(,Tm)Tm=（G+C）%×0.41+69.3在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火。DNA复性复性RNADNA(一)定义：是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上二、探针（probe）(二)探针的分类根据探针的核酸性质分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针、寡核苷酸探针1.cDNA(complementaryDNA)⑴克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽⑵较不易被降解⑶标记方法可靠易行优点互补于mRNA的DNA分子（长度为数百-数千碱基对）优点：⑴杂交效率比DNA探针高⑵在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定缺点：容易受RNA酶的污染而被降解2.RNARNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上合成优点：形成杂交体快速(序列短，杂交时易于穿透)缺点：特异性较低（短链和简单）3.寡核苷酸短链探针(长度10-50个核苷酸)1.标记物3H、32P、35S、125I等。(三)探针的标记(1)放射性标记物特点：敏感性高半衰期，放射性污染，成本高，耗时长VermotJ.2000.Endocrinology.XieHRetal.2007.PANS35S35S(2)非放射性标记物生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时短，标记探针可较长时间的保存和使用特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似较放射性标记系统安全，方便、省时间定位准确，杂交背景好地高辛（Digoxigenin简写Dig-）类固醇半抗原分子人及多种动物体内不存在类似的物质，无交叉反应地高辛标记探针的显色检测常用免疫酶学显色检测方法有两类：Dig-HRP检测系统以DAB/H2O2为底物，结果为棕色；以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物，结果为蓝色。Dig-AKP检测体系以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。DiaoHL.2007.Fertil&Steril地高辛在植入期子宫中的定位2.标记方法(1)DNA探针标记①切口移位法DNaseI在DNA双链上造成单链切口DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入②随机引物法随机引物能与各种单链DNA模板结合DNA聚合酶按53方向合成一新的DNA链。带标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中(2)RNA探针标记在体外转录技术中与探针制备同时完成(3)寡核苷酸探针标记末端转移法CCCCCC取材、切片杂交观察、照相三、原位杂交技术的基本步骤显色原位杂交技术的基本步骤与原理原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的包括：组织和器材的特殊处理取材、固定、切片杂交前处理探针的制备和预杂交杂交反应杂交后处理检测杂交信号，进行结果分析（一）器材的特殊处理DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNA原位杂交RNA：RNA酶几乎无处不在，而且一般的消毒方法不能将其灭活。因此，当检测RNA或用RNA作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要注意预防1.物理方法：对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘烤（180-200℃干烤4-6小时）对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒2.化学方法：焦碳酸二乙酯(DEPC)RNA酶抑制剂，有毒去除或抑制RNA酶方法：(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒(2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶(3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37℃，2h)，蒸馏水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上(4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理整个操作过程带手套和口罩。(二)取材目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态结构。基本与免疫组织化学技术相似。取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制处理的器具接触标本所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用DEPC水清洗。为防止RNA迅速降解，标本离体切小，迅速投入4％多聚甲醛溶液内，置4℃冰箱内2-4小时。再将组织移入30％蔗糖PBS溶液内，4℃冰箱内过夜。次日可将标本储存于-80℃低温冰箱内保存。标本的储存组织制片冷冻切片以厚5~30um最佳。40℃烤箱内干燥2小时后储存在-80℃超低温冰箱在-20℃可保存２～３周，在-70℃可保存数月之久石蜡切片，一般不提倡浸入二甲苯溶液。(三)杂交预处理1.切片脱蜡及水化脱蜡及水化过程与普通石蜡切片相同要求：脱蜡要彻底，否则影响探针对组织细胞的穿透RNA杂交:需DEPC水替代蒸馏水稀释酒精切片入DEPC水浸泡2.增强标本通透性与核酸探针穿透性常用方法：蛋白酶消化、去污剂处理、酸酐处理和稀酸洗涤等(1)蛋白酶K（甘氨酸）、胃蛋白酶（4％多聚甲醛后固定）酶的浓度和孵育时间应视标本种类、固定剂种类、切片厚度等而确定(2)去污剂处理TritonX-100最常用注意：去污剂处理不当，会引起靶核苷酸的丢失，影响标本的形态结构(3)酸酐处理和稀酸洗涤防止探针与标本内的碱性蛋白发生静电效应，减少杂交反应的背景色3.预杂交杂交之前使用不含核苷酸探针的杂交液在杂交温度下预先孵育切片，以达到封闭或阻断与核苷酸探针产生非特异性杂交点，降低背景着色的目的。标记的探针与检测标本上的靶序列结合而形成杂交体的过程。这是原位杂交技术的关键步骤。包括：探针的准备双链核酸的变性杂交反应(四)杂交反应探针长度：50－100个碱基最佳探针标记物：地高辛（DIG）探针浓度：0.5－5.0μg/ml;杂交液的量要适当，以10～20μl/每张切片为宜1.探针准备理论热变性温度：90℃－95℃甲酰胺法：常规的加入30～50%甲酰胺于杂交液中每增加1%，Tm值降低0.72℃，降至37-40℃为宜注意：在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷却，以保持变性后单链状态。当靶核酸或探针为DNA时，杂交前需要变性为单链2.探针和靶核酸变性探针——预变性的探针高浓度盐类(柠檬酸钠)——增加杂交体的稳定性甲酰胺——可降低解链温度硫酸葡聚糖——对DNA有浓缩作用，可提高杂交的反应速度10倍以上，但不影响探针的洗脱强度牛血清白蛋白和鲑鱼精DNA或RNA——用于阻止探针与非特异位点或非目标DNA杂交。3.杂交液的组成方法：杂交液滴于切片上，加盖硅化的盖玻片。杂交的温度：在Tm-25℃左右，大约在30～60℃之间时间：16－20小时，一般过夜。PH：6.5－7.5含50%甲酰胺、盐浓度0.75mol/L左右时，杂交温度：DNA探针是42℃RNA探针是50-55℃寡核苷酸探针是37℃4.温度、时间和PH目的：尽可能洗去未杂交或非特异性吸附的探针。方法：系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。RNA探针杂交后漂洗液中的可加入RNA酶原则：是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高(五)杂交后处理(六)杂交体的检测生物素标记的探针地高辛标记的探针酶标记卵白抗生物素抗体酶标记链霉抗生物素抗体连接酶标记抗地高辛抗体标记酶：HRP、AlP靶核酸分子地高辛标记探针碱性磷酸酶联结的抗地高辛抗体(七)原位杂交详细步骤1、二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。DEPC水洗2次，DEPC-PBS洗2次，5分钟2、DEPC-PBS处理的Triton-X100处理15分钟3、DEPC-PBS洗2次，5分钟4、TE缓冲液稀释的蛋白酶K（5-20μg/ml）37℃孵育15～20min5、用0.1mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗1min终止蛋白酶K的消化，DEPC-PBS洗2次，5分钟6、DEPC-PBS-4%多聚甲醛后固定10-15分钟7、DEPC-PBS洗2次，5分钟8、2×SSC洗5分钟9、不含探针的杂交液中37℃孵育2h10、2×SSC洗5分钟11、含探针杂交液中37℃(42-55℃)孵育18h12、1×SSC在室温下速洗，1×SSC在55℃水浴摇洗，2×15min，0.5×SSC在55℃水浴摇洗2×15min，0.5×SSC在室温下洗10min13、放射自显影或酶显目的：保障实验结果的准确性和特异性标本对照、探针对照、杂交体对照、检测系统对照阴性对照：排除非特异性杂交等因素造成的假阳性阳性对照：证明杂交步骤及试剂可靠性对照实验设置愈多，实验结果的可靠性就愈大。注意：每次实验都应有阳性对照和阴性对照四.对照实验的设置常用的实验对照(1)标本对照：选用已知为阳性或阴性的组织(2)空白实验:无探针的杂交液进行杂交(3)选用其他生物学方法进行对照实验提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern印记杂交、qPCR、RT-PCR等。（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应（5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关的核酸探针进行杂交。（6）探针孵育后的检测系统对照1.标本形态结构不佳取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解杂交预处理中蛋白酶消化不当所致杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮或脱片五.实验结果可能的问题和原因2.杂交信号弱探针链太长不易深入细胞探针的标记不好靶序列暴露程度不佳探针和（或）靶序列的变性条件欠佳3.无杂交信号标本内无靶序列的存在标本内存在靶序列，因实验某个环节的失误导致后者可能降解4.非特异性着色探针特异性组织细胞内的内源性酶组织细胞内的某些成分与检测系统的抗体非特异性结合基本实验过程总结放射自显影免疫细胞化学样品制备→切片探针制备、标记→纯化→通透处理→变性↓原位杂交↑→杂交体探测：小结Thankyou！常用试剂1．4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）配法：称取40gPFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH调pH值至7.0，使呈清亮状，再加入约500ml2×PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。注意：①配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；②加热时，温度不宜过高，常为60～65℃，否则，PFA降解失效；③配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，建议尽早使用。2、杂交用液1)SSC(StandardSalineCitrate)通常配成10×，20×，50×的储备液，如下：先称取上述两种试剂，溶于约800mlddH2O中，滴加10N的NaOH，将pH值调至7.0，补足ddH2O至1000ml，加入终浓度为0.1%～0.2%的DEPC，分装后高压灭菌，可室温保存。在用于杂交的湿盒内也常用5×SSC以保持一定湿度。2）杂交液及预杂交液