9第九章核酸类药物的分析

第九章核酸类药物的分析基本要求掌握：核酸的结构和分类；嘌呤类药物和嘧啶类药物鉴别、检查、含量测定的原理熟悉：核酸的理化性质；反义寡核苷酸药物鉴别、检查、含量测定的原理第一节概述结构和分类理化性质什么是核酸？1869年核酸最早分离自外科绷带脓细胞的细胞核，当时发现这种物质含磷量之高超过当时发现的任何一种有机物，并且含有很强的酸性，故得名核酸。1909年其组成被研究清楚，1944年生物功能初步澄清，在X射线衍射技术支持下1953年结构澄清。核酸是脱氧核糖核酸（DNA）与核糖核酸（RNA）的通称。核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基水解一、结构和分类核酸代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA而言为核糖；代表碱基代表磷酸基核苷酸核苷酸磷酸碱基戊糖NNNNNHHNHNHOOOOHOHOHOHCH2H2OPOHOOOH2O碱基磷酸戊糖糖苷键酯键核苷酸碱基连接（糖苷键）酯键（对DNA为H）1`2`3`4`5`戊糖核糖(inRNA)2｀－脱氧核糖(inDNA)核苷DNA&RNA碱基RNADNA嘧啶环嘌呤环尿嘧啶U胸腺嘧啶T胞嘧啶C鸟嘌呤G腺嘌呤A类别DNARNA基本单位脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸腺嘌呤核苷酸鸟嘌呤核苷酸胞嘧啶核苷酸尿嘧啶核苷酸碱基腺嘌呤（A)鸟嘌呤（G)胞嘧啶（C)胸腺嘧啶（T)腺嘌呤（A)鸟嘌呤（G)胞嘧啶（C)尿嘧啶（U）五碳糖脱氧核糖核糖酸磷酸磷酸稀有碱基•嘌呤——次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、N2、N2-二甲基鸟嘌呤。•嘧啶——5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶•都是基本碱基的化学修饰型。NNNNONH2H鸟嘌呤NNNNOH次黄嘌呤CH31-甲基次黄嘌呤二、理化性质（一）两性性质：磷酸基；碱基（通常：酸性）pH影响碱基间氢键稳定：DNApH4.0~11.0（二）水解性：微溶于水，不溶于一般的有机溶剂（三）UV：λmax=260nm蛋白质280nmA260/A280纯DNA＞1.8纯RNA应达到2.0混有杂蛋白比值降低（四）变性和复性1.变性：在某些理化因素影响下，DNA双螺旋区的氢键断裂和碱基堆积力破坏，有规律的双螺旋结构变成单链无规律的“线团”，但不发生共价键的断裂，这过程称之。变性原因：高温（一般＞75℃）、强氧化剂、强酸、碱、尿素等；机理：双链间氢键断开，成为两条单链（DNA双螺旋二级结构的破坏，生物活性的丧失）特征性Tm---DNA的变性温度82~95℃2.复性一定条件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构及生物活性的现象；通常使用热复性。（退火）高温变性缓慢冷却热复性急速冷却复性失败热复性在基因测序中被广泛应用（五）颜色反应苔黑酚反应:RNA中核糖+浓HCl（浓H2SO4）→糠醛+苔黑酚→深绿色化合物（λmax=670nm）二苯胺反应:DNA中脱氧核糖+浓H2SO4→5-羟基-4-羰基戊醛+二苯胺→蓝色化合物（λmax=595nm）水解后磷酸：磷酸+钼酸→磷钼酸+还原剂（维生素C、氯化亚锡等）→钼蓝（λmax=660nm）Fe3+脱水第二节嘌呤类核苷酸药物分析嘌呤碱（腺嘌呤、鸟嘌呤）戊糖磷酸一、鉴别戊糖鉴别嘌呤鉴别磷酸鉴别特征吸收光谱熔点测定（一）戊糖的鉴别苔黑酚反应（地衣酚反应）---凡核糖均有此反应试剂：浓盐酸，苔黑酚试剂，三氯化铁（催化剂）现象：鲜绿色二苯胺反应DNA试剂：浓硫酸，二苯胺现象：蓝色与间苯三酚反应（核苷酸中的戊糖）现象：玫瑰红色（二）嘌呤的鉴别+氨制硝酸银→白色↓→红棕色（遇光）（嘌呤碱基的特殊鉴别反应）（三）磷酸的鉴别有机磷→无机磷+钼酸→磷钼酸+还原剂→钼蓝（四）特征吸收光谱UV：嘌呤环，嘧啶环IR（五）熔点测定二、检查一般检查酸度，水分，无机盐，有机物，溶液的颜色和澄清度蛋白质检查磺基水杨酸溶液有关物质纸色谱，薄层色谱，电泳，荧光检查三、含量测定紫外-可见分光光度法现在国家已经批准的嘌呤类核苷酸药物一般都用此法测定含量HPLC四、实例分析肌苷ATP（一）肌苷的质量分析1.结构：C10H12N4O5268.23本品为9β-D-核糖次黄嘌呤。按干燥品计算，含C10H12N4O5应为98.0～102.0％。2.性状：本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦。本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀盐酸和氢氧化钠溶液中易溶。3.鉴别取0.01％供试品溶液适量,加等体积的3,5-二羟基甲苯溶液(取3，5-二羟基甲苯与三氯化铁各0.1g，加盐酸使成100ml)，混匀，在水浴中加热约10分钟，即显绿色。---苔黑酚反应取本品1％水溶液，加氨制硝酸银试液数滴，即产生白色胶状沉淀。---嘌呤碱基取含量测定项下的溶液,照分光光度法测定，在248nm的波长处有最大吸收，在222nm的波长处有最小吸收。色谱图IR4.检查溶液的澄清度与颜色（溶液的透光率）取本品0.5g，加水50ml使溶解，照分光光度法在430nm的波长处测定透光率，不得低于98.0％(供注射用)。干燥失重取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过1.0炽灼残渣不得过0.1％(供注射用),或不得过0.2％(供口服用重金属取本品1.0g，依法检查含重金属不得过百万分之十。次黄嘌呤①精密称取本品0.5g，置50ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照纸色谱法试验，吸取上述溶10μl，点于3×25cm色谱滤纸上，照上行法，以水为展开剂，展开约20cm处，取出晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，不得出现杂质斑点。②HPLC5.含量测定1）UV法：取本品，精密称定，加水制成每1ml中约含10μg的溶液，照分光光度法在248nm的波长处测定吸收度，按C10H12N4O5的吸收系数（E1％1cm）为460计算。2）HPLC6.作用与用途辅酶类药。有改善机体代谢作用。用于各种类型肝脏疾患、心脏疾患、白细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、视神经萎缩等。7.用法与用量口服，一次0.2～0.6g一日0.6～1.8g8.贮藏遮光，密闭保存。9.制剂(1)肌苷口服溶液(2)肌苷片(3)肌苷注射液(4)肌苷胶囊(5)肌苷颗粒剂（二）三磷酸腺苷二钠（ATP）的质量分析拼音名：Sanlinsuanxiangan‘erna英文名：AdenosineDisodiumTriphosphateC10H14N5Na2O13P3551.151.结构：本品为腺嘌呤核苷-5’-三磷酸酯二钠盐三水化合物。按干燥品计算，含C10H14N5Na2O13P3不得少于90.0％。2.性状：本品为白色或类白色粉末或结晶块状物；无臭，味咸；有引湿性。本品在水中易溶，在乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶。3.鉴别（1）取本品20mg,加稀硝酸2ml溶解后，加钼酸铵试液1ml，加热，放冷，即析出黄色沉淀。---磷酸盐（2）取本品约10mg，加盐酸溶液(1→2)5ml溶解后，加间苯三酚10mg，混匀，置水浴中加热约1分钟，即显玫瑰红色。--戊糖（3）苔黑酚反应—戊糖（3）UV（4）IR（5）本品的水溶液显钠盐的鉴别反应4.检查酸度溶液的澄清度与颜色蛋白质取本品20mg，加水2ml溶解后，滴加30％磺基水杨酸溶液0.5ml，不得发生浑浊。有关物质水分氯化物铁盐重金属热原5.含量测定（1）总核苷酸：UV（2）三磷酸腺苷二钠的重量比：HPLC（3）色谱条件与系统适用性试验（4）测定法6.作用与用途辅酶类药。用于进行性肌萎缩、脑溢血后遗症、心功能不全、心肌疾患及肝炎等。7.注意缓慢注射。心肌硬塞和脑溢血在发病期患者慎用。8.贮藏有阴凉干燥处密封保存。有效期１年。9.制剂(1)三磷酸腺苷二钠注射液(2)注射用三磷酸腺苷二钠第三节嘧啶类核苷酸药物的分析一、鉴别该类药物的化学组成和性质本与嘌呤类相似，唯一区别在于碱基的不同。一元碱二、检查常规检查其他核苷酸：TLC三、含量测定UV法电位滴定法四、实例分析---氟尿嘧啶1.通用名:氟尿嘧啶化学名:5-氟-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮分子式:C4H3FN2O2分子量:130.08熔点:278-286℃水溶性:12.2g/L20℃含氟尿嘧啶（C4H3FN202）应为标示量的93.0-107.0%2.性状：白色或类白色结晶或结晶性粉末。在水中略溶，乙醇中微溶，三氯甲烷中几乎不溶，在稀盐酸或氢氧化钠溶液中溶解。3.鉴别（1）+溴，溴褪色；+氢氧化钡，紫色↓（2）三氧化铬的饱和硫酸溶液，均匀涂于管壁本品，不能再均匀涂于管壁（3）λmax=265nmλmin=232nm（4）IR4.检查：氯化物硫酸盐含氟量干燥失重重金属5.含量测定：取本品适量，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1mL中约含10μg的溶液，照紫外-可见分光光度法，在265nm波长处，测定吸光度，按C4H3FN2O2的吸收系数（E1%1cm）为552计算，即得。用途：本品为嘧啶类的氟化物，属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核，干扰DNA合成。对RNA的合成也有一定的抑制作用。不良反应：骨髓抑制：主要为白细胞减少、血小板下降。食欲不振、恶心、呕吐、口腔炎、胃炎、腹痛及腹泻等胃肠道反应。注射局部有疼痛、静脉炎或动脉内膜炎。其他：常有脱发、红斑性皮炎、皮肤色素沉着手足综合征及暂时性小脑运动失调，偶有影响心脏功能注意事项：用药期间应严格检查血象。避光置阴暗处保存，温度不应低于10℃，亦不宜超过35℃。治疗期涂药范围有炎症，停药后炎症消退。本品可引起严重的皮肤刺激，尤其在日光下。该药还可经皮损内注射给药用于角化棘皮病、疣和汗孔角化病。其主要副作用为注射期间有的烧感，继之有局部红斑、水肿甚至溃疡。第四节反义寡核苷酸药物分析1.定义2.化学修饰：硫代修饰3.序列分析：化学测序法；质谱法4.杂交性质5.理化特性分析（鉴别：HPLC，CE）（特殊杂质：失败序列；硫代不充分）6.生物活性测定