第十四章 色谱分析法导论(全)

1第14章色谱分析法导论•概述•基本概念和术语•色谱基本理论•色谱分离优化•定性和定量分析214-1概述1.色谱法混合物最有效的分离、分析方法。俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。（动画）3色谱法当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础42.色谱法分类(1)气相色谱：流动相为气体（载气）。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相不同分为：气固色谱和气液色谱(2)液相色谱：流动相为液体（淋洗液）按固定相不同分为：液固色谱和液液色谱离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。5(3)其他色谱方法薄层色谱和纸色谱：凝胶色谱法：测聚合物分子量分布。超临界色谱:CO2流动相。高效毛细管电泳:九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。63.色谱法的特点（1）分离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处：被分离组分的定性较为困难。714-2基本概念和术语色谱分离过程是在色谱柱内完成的。填充柱色谱:气固(液固)色谱和气液(液液)色谱，两者的分离机理不同。气固(液固)色谱的固定相:多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。分离机理:吸附与脱附的不断重复过程；气液(液液)色谱的固定相:由担体和固定液所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。分离机理：气液(液液)两相间的反复多次分配过程。81.气相色谱分离过程当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。92.色谱流出曲线与术语基线无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。保留值（1）时间表示的保留值保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间；调整保留时间（tR＇）：tR＇=tR－tM10（2）用体积表示的保留值保留体积（VR）：VR=tR×F0F0为柱出口处的载气流量，单位：mL/min。死体积（VM）：VM=tM×F0调整保留体积(VR＇)：VR＇=VR－VM11相对保留值r21组分2与组分1调整保留值之比：r21=t´R2/t´R1=V´R2/V´R1相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。12区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354（3）峰底宽(Wb)：Wb=4133.分配系数（partionfactor）K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：MsccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度分配系数是色谱分离的依据。14分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K154.分配比（partionradio）k在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：Msmmk组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。3.分配比可以由实验测得。分配比也称：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；165.容量因子与分配系数的关系式中β为相比。VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同；气-液色谱柱：VS为固定液体积；气-固色谱柱：VS为吸附剂表面容量；容量因子越大，保留时间越长。KVVccVVMVVMMMkmSmsmmSSSSmS176.分配比与保留时间的关系滞留因子（retardationfactor）：uuRSSus：组分在分离柱内的线速度；u：流动相在分离柱内的线速度；滞留因子RS也可以用质量分数ω表示：kmmmmmRS1111MsMss若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别为tR和tM，则：uLtuLtMSR;由以上各式，可得：tR=tM(1+k)M'RMMRtttttk1814-3色谱法基本理论色谱理论需要解决的问题：分离效果为何不同？色谱峰为何变宽？影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。两种色谱理论：塔板理论和速率理论；19塔板理论的假设：(1)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(2)将载气看成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)每次分配的分配系数相同。14-3-1塔板理论-柱分离效能指标1.塔板理论（platetheory）半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；202122讨论：•(1)最大浓度在n=8，n=9处•(2)峰形不对称，n太少，若n＞50，则峰形对称，•GC中，n=103～106，趋近于正态分布曲线。232.柱效能评价(1)理论塔板数n和理论塔板高度H。由塔板理论可导出n=16（tR/Wb）2=5.54（tR/W1/2）2H=L/n，L——柱长(2)有效理论塔板数n有效和有效理论塔板高度H有效。n有效=16（tR＇/Wb）2=5.54（tR＇/W1/2）2H有效=L/n有效24•n有效/n=(tR′/tR)2=[]2•(3)峰越窄，n越多，H越小，柱效率越高，分离能力越强，•tR＇=tR-tM；•∵tM不参加柱内分配，∴n有效和H有效更能真实的反映色谱柱的分离能效能。•n=16(tR/Wb)2n有效=16(tR′/Wb)2•n有效=n（k＇/1+k＇)2tR′/tM(tR′+tM)/tM25塔板理论的价值和局限性•1、解释流出曲线形状（呈正态分布）•2、浓度极大点位置•3、评价柱效能•局限性：•不完全符合色谱柱实际过程，只考虑热力学因素。未考虑动力学因素。不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。•塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。2614-3-2速率理论•1956年VanDeemter.GLC•范第姆特方程式H=A+B/u+Cu•A—涡流扩散项•B—分子扩散项系数•C—传质阻力项系数•u—流动相平均线速度（cm/s）A、B、C三项各与哪些因素有关？271.涡流扩散项A（多径项）•A=2λdpλ—填充不规则因子•空心毛细管A=0dp—固定相颗粒直径•由于填充物颗粒大小不同及填充不均匀使分子受阻不同，使同一组分中不同质点到达柱出口所需要时间不同而导致峰变宽。固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。282.分子扩散项B/u（纵向）•B=2γDg•γ—弯曲因子固定相颗粒对分子扩散的阻碍。γ填充柱：γ=0.5~0.7空心柱γ=1•Dg—组分在流动相中的扩散系数（cm2/s）。存在着浓度差，产生纵向扩散;扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;29B=2γDg•Dg↑分子扩散越严重•（1）组分性质：组分M↑Dg↓•（2）载气性质：Dg∝1/√M载气重载气N2：M大Dg小轻载气H2：M小Dg大•（3）柱温T↑，Dg↑；柱压p↑，Dg↓•uu越小，组分在柱中停留的时间越长，分子扩散越严重。•当u大时，B/u可忽略；u小时，B/u较大•∴为降低分子扩散项，宜使用分子量较大的载气和较大的u和较低的柱温。303.传质阻力项CuC=Cg+CL•气相传质阻力Cgu—•组分从气相到两相界面所需要时间越长，则Cgu越大。0.01k＇2(1+k＇)2Cg=×dp2Dg•dp—填充物颗粒平均直径•采用粒度小的填充物dp↓，Cg↓•采用M小的载气（H2）Dg大，Cg↓31液相传质阻力CLu•组分分子从两相界面进入固定相的深度不同，进入固定相所用的时间不同，引起峰的扩张。•df—液膜厚度越小，传质阻力越小•DL—组分在固定相中扩散系数越大，传质阻力越小。•提高T可使DL，CL,但k′，↑↓↓•故应控制适当的柱温。CL=2k′3(1+k′)2×df2uDL32范第姆特方程（速率方程）H=A+B/u+Cu•H=2λdp+2γdg/u+[+]u0.01k′2(1+k′)2×dp2Dg2k′df23(1+k′)2DL33H=A+B/u+Cu=A+B/u+Cmu+Csu+Csmu纵向扩散可忽略，简化为：H=A+（Cm+Cs+Csm）u三、液相色谱中速率理论34四、范氏方程曲线H-u载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。35速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。3614-4分离度•一、柱效和选择性•1.柱效H有效=L/n有效,•n有效=16(tR′/Wb)2=5.54(tR′/W1/2)2反映峰扩张程度•2.选择性α=tR′(2)/tR′(1)(r2,1)反映两峰保留值差别37柱效H有效n有效=5.54(tR′/W1/2)2选择性α=tR(B)ˊ/tR(A)ˊ•分离情况•柱效•选择性没有分离分离完全分离完全不好不好好不好好同（a）38二、分离度定义(分辨率)－色谱图中相邻两峰分离程度的量度•一般RS1明显重