原生质体的分离与融合(1)

原生质体的分离与融合什么是原生质体原生质体，是指出去细胞壁的植物细胞的部分。由Hanstein1980年提出在适当条件下，原生质体可以成功培养长出细胞壁，并通过细胞分裂。原生质体不仅对细胞融合研究有价值，且能通过裸露的质膜获得外源DNA、细胞器、细菌和病毒颗粒等。一、原生质体分离原生质体分离的基本原则是保证原生质体不受伤害并不损害其再生能力。1.机械法只有储藏组织中较大的、高度液泡化的细胞才能用于分离原生质体，如洋葱球茎鳞片、萝卜根、甜菜根等；缺点：产量低；方法枯燥无力；因破碎细胞释放物的存在，原生质体活力低。2.酶法Cocking在1960年证实了可用酶分离原生质体。Takabe等1968年首次用商业酶试剂分离原生质体，并在1971年获得再生植株。缺点是：不纯酶制剂所含的杂质可能会对原生质体产生不同程度的毒害作用。原生质体的分离二、影响原生质体分离的因素原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。1组织和细胞材料的生理状态植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应当处于生长早期或指数生长期。采用愈伤组织或悬浮细胞，采用其材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒。二、影响原生质体分离的因素2酶①纤维素和半纤维素是细胞壁的初生结构和次生结构的成分，果胶类物质是连接细胞胞间层的成分。②纤维素酶（降解构成细胞壁的纤维素）、半纤维素酶、果胶酶（使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞分开）③酶活性与pH有关，4.7~6.0，温度一般在25~30℃二、影响原生质体分离的因素3渗透剂原生质体直接释放到培养基中会破裂，因此，在分离原生质体期间，须对原来细胞壁机械维持压力用原生质体分离混合液以及后来培养基的适当渗透压代替。在合适的渗透压溶液中，刚分离的原生质体看起来是球状的。二、影响原生质体分离的因素4原生质体的纯化酶消化后得到的混合物含有亚细胞碎片、未消化的细胞、破碎的和完整的原生质体。可通过对此混合物通过过滤、离心、漂洗联合的方法进行纯化。1）收集：原生质体混合液用滤网（40~100μm）去掉没有降解的细胞及组织，收集滤液。2）洗涤：将网下物低速离心，去掉上清液，再加无酶液的CPW液悬起起原生质体，再离心，弃上清，重复几次即可。3）纯化（上浮法和下沉法）上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23%左右）混合。下沉法是讲原生质体与13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。两种方法中，均在离心5~10分钟后，在蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。用吸管将带轻轻吸出来，悬浮离心，稀释后用于培养。二、影响原生质体分离的因素5原生质体的活力测定和密度原生质体的真正活力使原生质体有能力通过持续有丝分裂，再生成愈伤组织，并最终再生成植株。测定原生质体活力的方法主要有：FDA（荧光素二乙酸）染色法；酚藏红花（CFW）染色法；测定呼吸强度法等。影响原生质体分离的因素6培养基成分培养基中应当去除铵，因为它对原生质体的生存是有害的，而铁、锌的含量也应当减少。另外，钙的浓度应当比通常培养细胞所需的浓度增加2~4倍，提高钙的浓度能改善膜的稳定性。葡萄糖是最好最可靠的碳源，其次为蔗糖。7环境因子一般来说，刚开始培养时高光强会抑制原生质体的生长，因此应先在黑暗或弱光下培养几天，再将其转移到一般光强下培养。温度范围20~28度适宜，pH范围5.5~5.9适宜。三、原生质体培养原生质体培养1.液体浅层培养（Liquidthinlayerculture）原生质体纯化后，将原生质体悬浮于液体培养基中，取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口培养。2.固体培养（Solidculture）也叫琼脂糖平板法或包埋培养法。将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂（琼脂或琼脂糖）按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。3.固液双层培养法（Solidoverliquidculture）即先在培养皿底部铺一层固体培养基，待凝固后再在其上进行液体浅层培养。固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收。细胞再生（1）细胞壁形成不同植物原生质体再生细胞壁所需时间不一样，从几小时到几天。原生质体失去其圆球形特征表明了新细胞壁的再生。简单鉴别壁再生的方法是用荧光增白剂（CFW）染色法检测到。（2）细胞分裂第一次细胞分裂一般发生在2~7d内，分裂活跃的细胞悬浮培养的原生质体与叶片高度分化细胞的原生质体相比，前者进入第一次细胞分裂较快。（3）植株再生具有再生能力的原生质体就会不断分裂形成多细胞团。当细胞团进一步发育成为肉眼可见的小愈伤组织，要及时转移到分化培养基（Differentiationmedium）中，培养与再生过程同一般的愈伤组织培养。体细胞杂交离体条件下，通过分离体细胞原生质体融合产生杂合体，再通过其异核体的发育形成杂种植株的技术被称为体细胞杂交。这个程序消除了杂交中性别因素。克服不亲和性障碍，成为植物基因的遗传操作方法。在体细胞杂交中，亲本的细胞核和细胞质在杂种细胞中融合了。有时，融合的杂合体中只有一个亲本的核基因，而有两个亲本的细胞质基因，这样的杂种叫胞质杂种。体细胞杂交物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。原生质体融合技术体系大致包括三大环节：1.诱导原生质体融合2.选择融合体或杂种细胞3.杂种植株的再生与鉴定(一)原生质体融合原生质体融合（Protoplastfusion）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。1自然融合（Spontaneousfusion）来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。(一)原生质体融合2诱发融合1)NaNO3处理法Power于1970年采用NaNO3溶液诱导燕麦与玉米根尖原生质体融合，首次得到融合体。1972年，美国学者Carlson等采用此法获得郎氏烟草与粉蓝烟草体细胞杂种，这是植物中首例体细胞杂种。缺点是Na+造成膜电位的改变。融合频率低。2)高pH-高钙法Keller和Melchers于1973年报道采用高浓度Ca2+的强碱溶液处理烟草叶肉原生质体，可以使融合频率大幅度增加，达到50%。之后，采用此方法成功获得了烟草种间和属间体细胞杂种。3)水溶性多聚体——聚乙二醇（PEG）法最成功的原生质体融合技术。1976年Kao发现用含高浓度Ca2+的强碱溶液清洗PEG诱导和原生质体时，融合频率得到到进一步提高，因而发展起高pH-PEG法。PEG诱导小麦与玉米融合产生不育杂种4)电融合法（Electrofusion）主要是双向电泳法，其基本原理：与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。电融合的基本过程：a.细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；b.膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。体细胞杂种的特点形态上的趋中性变异幅度大非整倍性双亲性状的共显性偏亲现象杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定1．杂种细胞的选择系统外观选择互补选择荧光标记选择2．体细胞杂种的鉴定任何两个种的原生质体都可以融合在一起。然而，高等植物体细胞杂交的广泛利用收到一些限制，包括非整倍体、杂交的种障碍和不可能从原生质体再生成植株等。杂种性的鉴定要求有证明两个融合亲本遗传贡献的清楚证据，而杂种性只能来源于整倍体，而不能来源于非整倍体。形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。杂种在形态上往往介于双亲之间，包括株型、叶形、花器官等细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。染色体计数：染色体数目是双亲之和，或少1至几条染色体。所以，细胞融合可以创造非整倍体。代换系、染色体片段置换系等珍贵的遗传学研究材料。这些遗传材料对于基因定位、确定染色体与分子标记连锁群的关系、育种等有重要应用价值。生化鉴定：同功酶鉴定分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定是最有效的检测手段，尤其是细胞学无法确定是杂种的时候，分子标记更有用，它能检测出遗传物质的细小重组。体细胞杂种的遗传特性1．细胞分裂与染色体丢失如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。如果这样就会产生几种情况：A细胞＋B细胞质；A细胞＋B细胞质和部分染色体或基因。体细胞杂种的遗传特性2．基因转移与性状表达由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。3．体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。体细胞杂种的应用一、体细胞杂种的应用潜力1、植物育种中的核质替换2、细胞质杂种的获得3、远缘杂交创造新物种4、细胞器的互作研究体细胞杂种的应用二、体细胞杂交面临的困难1、融合特性的高效性2、杂种细胞的培养和选择3、杂种的遗传稳定性控制体细胞杂种的应用三、体细胞杂交研究的发展趋势1、诱导融合及杂种细胞的各种生理、生化、遗传机理的研究2、电融合的程序化控制研究3、各种类型原生质体（胞质体、核质体、细胞器）的制备技术研究4、杂种细胞培养技术的程序化研究