DNA修复基因单核苷酸多态性与铂类药物抵抗研究进展

1DNA修复基因的单核苷酸多态性与铂类药物抵抗研究进展魏嘉刘宝瑞王亚平【主题词】药物遗传学；单核苷酸多态性；DNA切除修复【Subjectwords】pharmacogenetics;singlenucleotidepolymorphisms(SNPs);DNArepair目前肿瘤的“标准化疗”仍然是以解剖部位为基础选择化疗药物的治疗。由于肿瘤本身以及个体之间异质性的存在，同一部位的肿瘤对“标准化疗”的敏感性和毒副作用差异很大。长期以来，人们追求根据肿瘤自身药物敏感性为指导开展个体化的药物治疗。最近3年，随着人类基因组计划的完成，恶性肿瘤的分子亚分类成为可能，以药物敏感相关基因为检测目标的药物基因组学（pharmacogenomics）、药物遗传学（pharmacogenetics）获得快速发展，使个体化的化疗成为可能。2004年美国临床肿瘤学会（americansocietyofclinicaloncology,ASCO）年会上有人预测，未来5-10年将是由当今标准化疗向个体化疗的过渡期。在化疗药物与相关基因的研究领域，铂类药物与DNA修复基因的单核苷酸多态性研究是最受瞩目的内容之一。单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）作为个体差异的遗传学作者单位：210008南京南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心(魏嘉、刘宝瑞)，南京大学医学院(王亚平)通讯作者：刘宝瑞(E-mail:[e-mail])2基础已经受到高度重视，成为全新一代遗传标记，是基因组学及遗传学研究的主要工具之一。SNP是人类和动物基因组中普遍存在的一种分子标记，通常是特定碱基位点的两个等位基因存在，其中较低的等位基因频率大于1/100时，该位点即为单核苷酸多态性位点。通过检测SNP的遗传多态性标记揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异的根本原因，是SNP在药物遗传学中的重要应用。1DNA修复能力与铂类药物抵抗铂类药物（顺铂、卡铂、草酸铂）是临床上最常用的一类化疗药物。铂类药物进入肿瘤细胞后与DNA结合，形成Pt-DNA加合物，导致DNA的链间或链内交链，引起DNA复制障碍，从而抑制肿瘤细胞分裂[1]。对铂类药物的抵抗可以通过以下机制发生：减少药物积聚；通过共扼结合去除药物毒性；提高对铂类药物诱导产生的DNA加合物的耐受性；或者提高DNA修复能力（DNArepaircapacity）。其中，DNA修复能力是影响疗效的重要原因。DNA切除修复(DNArepair)途径主要有四种：①碱基切除修复（base-excisionrepair,BER）②DNA双链断裂修复（DNAdouble–strand-breakrepair,DDSBR）③错配修复（mismatchrepair,MMR）④核苷酸切除修复（nucleotide-excisionrepair,NER）。关于各种DNA修复途径在个体之间以及不同的年龄阶段有很大的变异性。它们各自的特点可直接导致肿瘤细胞对DNA相关的细胞毒性药物的敏感性存在差异。其中，NER与铂类药物的抵抗密切相关，BER也在化疗药3物的抵抗中发挥了重要作用[2]。下面分别就BER及NER途径中关键因子的单核苷酸多态性与铂类药物抵抗综述如下。2碱基切除修复（base-excisionrepair,BER）碱基切除修复包括三个步骤：①DNAN-糖基化酶(DNAglycoslase)识别异常碱基，使异常嘌呤的N5和异常嘧啶的N3与脱氧核糖之间的键发生水解，DNA链上形成无嘌呤嘧啶位点；②AP核酸内切酶(APendonuclease,APE)在AP位点上游切开缺口，使一端成为5’-磷酸基，另一端成为3’-OH；③DNA多聚酶(polymerase)重新合成正确的碱基，最后由连接酶(ligase)将其连接。2.1XRCC1(X-rayrepaircross-complementinggroup1)参与碱基切除修复且与铂类药物抵抗有关的重要因子是X线修复交叉互补基团1(X-rayrepaircross-complementinggroup1,XRCC1)。XRCC1定位于人类染色体19q13.2-13.3，大小为33kb，包含17个外显子。纯化的XRCC1蛋白由633个氨基酸残基组成。XRCC1作为脚手架蛋白，通过直接与DNA聚合酶β、DNA连接酶Ⅲ和多聚二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)核糖聚合酶（polyADP-ribosepolymerase,PARP）形成复合物，共同参与因电离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复和单链断裂修复,对维持基因的稳定性发挥十分关键的作用。有研究者报道XRCC1基因多态性与肺癌、食管癌、乳腺癌、胃4癌、鼻咽癌等多种肿瘤患病风险增加有关[3-8]，这些结果都间接证明了XRCC1多态性可能影响DNA修复途径。Stoehlmacher[9]等对61例接受5-Fu和草酸铂治疗进展期结肠癌患者的XRCC1进行了多态性分析，发现XRCC1基因上Arg399Gln的SNP与化疗效果明显相关：73％的缓解者具有G/G基因型，而对化疗没有反应的患者中66％为A/A或G/A基因型(p=0.038)。相同位点的SNP在肺癌患者中也有报道：对103例接受以铂类为基础药物化疗的Ⅲ-Ⅳ期非小细胞肺癌患者，研究其XRCC1-399SNP发现，增加变异型等位基因的个数总生存期明显下降[10]。XRCC1基因的这一SNP在具体功能上的改变并未完全清楚，但是在该位点上含有A的XRCC1明显导致DNA修复能力的下降[11]。3核苷酸切除修复（Nucleotideexcisionrepair,NER）核苷酸切除修复（Nucleotideexcisionrepair,NER）是机体正常细胞针对DNA加合物、紫外线导致的嘧啶二聚体等DNA链上较大损伤的修复过程，它由多种DNA修复酶组成。修复过程分为五步①核酸酶多蛋白复合物识别DNA损伤部位：关键因子有XPA(xerodermapigmentosumpomplementarygroupA)、RPA(replicationproteinA)、XPC(xerodermapigmentosumpomplementarygroupC)；②由XPD(xerodermapigmentosumpomplementarygroupD)及TFⅡH(TranscriptionfactorⅡH)形成的复合物解旋DNA分子；③在损伤部位的两端引入切割酶切下损伤的核苷酸片段：由核苷酸切除修复酶5ERCC1(excisionrepaircross-Complementing1)和XPF(xerodermapigmentosumpomplementarygroupF)组成的ERCC1/XPF复合物切开受损DNA链的5′端，由XPG(xerodermapigmentosumpomplementarygroupG)切开受损DNA链3′端,从而切除受损的片段；④在DNA聚合酶的催化下,以完整的互补链为模板合成一小段核苷酸,填补已切除的空隙；⑤由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。NER途径中与铂类药物抵抗有关的关键因子有：ERCC1、XPD、XPG等。3.1ERCC1(excisionrepaircross-Complementing1)ERCC1基因定位于染色体19q13.2-13.3，其正常表达是维持该修复酶功能的分子基础。已有很多文献报道了ERCC1mRNA表达水平与铂类药物的敏感性密切相关[12-13]。目前认为NER是主要的DNA修复途径，ERCC1作为NER系统的关键基因[2]，其mRNA表达水平可以当成铂类药物化疗效果的独立预测指标[1]。ERCC1的SNP与铂类药物抵抗也存在明显关系，研究较多的是ERCC1基因第118位密码子上的一碱基由C到T的变异：Ryu[14]等对109例接受以铂类药物为基础化疗的非小细胞肺癌的患者进行了ERCC1第118位密码子的多态性分析，具有C/C基因型患者（54/109,50.4%）的中位生存时间为486天（95%CI，333-x），而变异型C/T（45/109,42.1%）或T/T（8/109,7.5%）的中位生存时间为281天（95%CI，6214-376），两者具有显著性差异（p=0.0058）。Cox多因素模型分析ERCC1第118位密码子的多态性与化疗的敏感性有显著差异（p=0.0001）这些结果都提示：ERCC1第118位密码子上具有C/C基因型的患者对铂类药物较其他两种敏感，有较好的预后。有人推测ERCC1-118SNP是否通过影响其mRNA表达而与铂类药物抵抗相关，这个观点已有体外实验证明：在人卵巢癌细胞株中，含有野生型ERCC1序列的A2780/CP70细胞株比第118密码子变异型的MCAS细胞株对铂类药物较敏感。这些数据都表明，ERCC1的多态性与DNA修复能力相关，其具体机制可能是通过影响ERCC1mRNA表达水平或者影响ERCC1mRNA翻译成蛋白质[15]。3.2XPD(xerodermapigmentosumpomplementarygroupD)XPD（又称ERCC2）位于染色体19q13.2-13.3，在核苷酸修复（NER）系统中作为进化保守的DNA解旋酶，发挥5’→3’解旋酶活性，参与核苷酸切除修复和基因转录，在DNA损伤修复中起着重要作用。XPD的多态性可以改变DNA修复能力，与铂类药物的敏感性密切相关[16]。该基因第312和第751位密码子的SNP研究得最多。Asp312Asn和Lys751Gln不但存在连锁不平衡，而且其突变表型与DNA损伤修复能力的减弱密切相关。Hemminki等[17]报道,携带312Asn/Asn和715Gln/Gln的个体修复嘧啶二聚体的能力比野生基因型低50%。另外，一些流行病学研究显示,这两个多态性与肺癌、头颈鳞癌、基底细胞癌等恶性肿瘤发生有关[18-20]。7对73例接受5-Fu+草酸铂治疗的转移性肠癌患者分析其XPD基因多态性，发现XPD第751密码子的SNP与疗效显著相关。与10%的A/C或C/C患者相比，24%的A/A患者获得客观缓解率（P=0.015）[21]。此外中位生存期也与该多态性显著相关，A/A患者中位生存期17.4个月，而A/C杂合子12.8月，C/C纯合子3.3个月[21]。另外在一组对135例Ⅳ期的非小细胞肺癌患者接受铂类药物治疗并分析其SNP的研究中发现，XPD第751密码子的变异与疾病进展时间（timetoprogress）存在明显的相关性（p=0.03）[22]。还有研究表明：XPD-751SNP与化疗效果的关系与化疗药物的联合使用有关系：在接受GEM+DDP治疗的进展期非小细胞肺癌患者中，具有A/C基因型患者的疾病进展时间明显高于具有A/A基因型的患者(9.6monthsVS4.2months;p=0.03)。而在接受DDP+vinorelbine治疗的进展期非小细胞肺癌患者中，具有A/A基因型患者的疾病进展时间较长，接受docetaxel+DDP+vinorelbine方案的患者中，具有A/A基因型生存时间也较长。该文献还提示XPDmRNA的表达水平与其多态性相关[23]。关于XPD-312SNP研究也较多，但是和铂类药物抵抗的相关性结论并不一致，大多数研究报道G到A的变异并未导致药物敏感性的变化，但是联合DNA修复途径其他关键基因的SNP就显示与药物的敏感性密切相关。2003年ASCO会议上报道了103例Ⅲ-Ⅳ期非小细胞肺癌患者接受以铂类药物为基础的方案化疗，联合分析XPD第312密码子和XRCC1第399位密码子的SNP结果表明含有变异型等位基因的个数越多，其中位生存时间越短(p=0.009)[10]。相似的研究在大肠癌中8也有报道，106例接受5-Fu+草酸铂的Ⅳ期大肠癌患者中，分析其XPD-751、ERCC1-118、GSTP1-105和TS-3’UTR的S