EPO类药物的某些进展

·肾脏病基础·［作者单位］南京军区南京总医院解放军肾脏病研究所　　（南京，２１０００２）ＥＰＯ类药物的某些进展李世军　综述　谢红浪　审校　　关键词　肾脏疾病　贫血　促红细胞生成素　　贫血是慢性肾脏病（ＣＫＤ）最常见的并发症之一，常导致患者生活质量下降。美国健康与营养调查研究会和肾脏病基金会调查发现，当肾小球滤过率（ＧＦＲ）下降至６０ｍｌ／ｍｉｎ以下时，贫血的危险明显增大，当ＧＦＲ在３０～５９ｍｌ／ｍｉｎ时，约５％的患者出现贫血，而当ＧＦＲ降至１５～２９ｍｌ／ｍｉｎ时，４４％的患者发生贫血［１］。肾性贫血的原因包括慢性炎症、缺铁、红细胞寿命缩短，但最主要原因仍然是促红细胞生成素（ＥＰＯ）的绝对和相对缺乏（表１）。近年来，随着人们对肾性贫血病理生理研究的深入，治疗肾性贫血的药物也有一些新发现。本文主要综述肾性贫血的发病机制及ＥＰＯ类药物的研究进展。表１　肾性贫血的病因促红细胞生成素缺乏溶血绝对铁缺乏功能性铁缺乏叶酸缺乏肉碱缺乏慢性炎症铝中毒甲状旁腺功能亢进伴骨髓纤维化失血尿毒症骨髓抑制药物肾性贫血的病理生理ＥＰＯ的合成　ＥＰＯ是一种单链的酸性糖蛋白肽类激素。ＥＰＯ基因定位于染色体７ｑ１１～２２，包括３０００个碱基对，由５个外显子和４个内显子组成［２］。ＥＰＯ基因首先编码生成１９３个氨基酸的蛋白质前体，修饰过程中去除Ｎ端２７个氨基酸及１个羧基末端精氨酸，形成１６５个氨基酸的多肽，相对分子质量为３４ｋＤ［３］。约３０％～４０％的ＥＰＯ分子量由糖链组成，其主要成分是甘露糖、岩藻糖和唾液酸等，它们对于维持ＥＰＯ分子活性、防止ＥＰＯ失活等方面具有重要作用。因此，临床使用的ＥＰＯ尽管其糖链结构与天然ＥＰＯ并不完全相同，都是高度糖基化的分子。健康人ＥＰＯ血清浓度为１０～３０ｍＵ／ｍｌ左右，相当于２～７ｐｍｏｌ／Ｌ。体内并不贮存ＥＰＯ，因此体内ＥＰＯ浓度与合成速度有关。绝大部分ＥＰＯ由肾小管周围间质成纤维细胞合成。当红细胞压积在正常范围时，肾脏皮髓交界处的仅一小部分成纤维细胞合成低水平ＥＰＯ。而出现贫血时，间质合成ＥＰＯ的成纤维细胞可扩展至皮质浅部，引起ＥＰＯ合成增加。但在严重贫血的刺激下，也仅有不足２０％的皮质成纤维细胞可以合成ＥＰＯ。肝脏可合成少量ＥＰＯ，胎儿时期肝脏是合成ＥＰＯ的主要场所。但成人肝脏合成ＥＰＯ很少，不能补偿由于肾功能衰竭而导致的ＥＰＯ缺乏。ＥＰＯ受体与信号传导　ＥＰＯ是红细胞系统祖细胞发育所必需的生长因子，这一观点已在使用ＥＰＯ后出现抗ＥＰＯ抗体患者中得到证实［４］。ＥＰＯ抗体可导致骨髓红系统祖细胞缺乏，网织红细胞水平极低，红细胞生成几乎完全停止，完全依赖输血才能生存。事实上，ＥＰＯ受体活化后产生细胞内信号能促进幼稚红细胞生存，否则这些红细胞将出现凋亡。ＥＰＯ受体属于细胞因子受体超家族成员，自磷酸化后形成二聚体引起多种激酶活化从而激活多种信号传导途径。ＥＰＯ受体进入细胞核内促进不同·０７１·ＪＮｅｐｈｒｏｌＤｉａｌｙＴｒａｎｓｐｌａｎｔ　Ｖｏｌ．１６　Ｎｏ．２　Ａｐｒ．２００７的基因转录，包括抗细胞凋亡的基因ＢｃｌＸＬ，并能抑制诱导细胞凋亡分子的ｆａｓ配体或Ｂｉｍ、糖原合成激酶３等活化［５］。同时还可促进核转录因子（ＮＦκＢ）的释放，ＮＦκＢ则进入细胞核内促进不同的靶基因转录，包括多种抗细胞凋亡的分子，如伴Ｘ染色体凋亡抑制因子和细胞抑制凋亡蛋白２。另外，ＥＰＯ还可通过活化有丝分裂蛋白激酶促进细胞增殖［６］。ＥＰＯ合成的调节　缺氧是肾脏分泌ＥＰＯ的主要刺激因素。离体灌注肾脏中ＥＰＯｍＲＮＡ表达和ＥＰＯ分泌受到灌注液中氧浓度调控［７］，故机体主要通过肾内细胞感知血氧的变化来系统调控ＥＰＯ的合成。ＥＰＯ的合成通过低氧诱导因子（ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ，ＨＩＦ）调控，ＨＩＦ由一个β亚单位和一个α亚单位组成（ＨＩＦ１α或ＨＩＦ２α）［８］。正常氧浓度下，ＨＩＦα亚单位羟基化后，不断被蛋白酶降解。而缺氧条件下，ＨＩＦ则不能被羟化，性质稳定，蓄积的ＨＩＦ与ＥＰＯ基因相邻的调节ＤＮＡ序列的关键部位———低氧反应元件（ＨＲＥ）相结合，从而导致ＥＰＯ转录因子活化（图１）。图１　促红细胞生成素（ＥＰＯ）表达的调节［３１］大多数细胞均表达ＨＩＦ１α和ＨＩＦ１β，而表达ＨＩＦ２α的细胞较少。Ｈｕ等［９］发现ＨＩＦ１α对一些糖酵解基因有独特调节作用，而ＨＩＦ２α则对内皮细胞特异基因有调节作用。近来研究发现ＨＩＦ２α是ＥＰＯ合成的主要调控因子，ＨＩＦ２α基因敲除小鼠ＥＰＯ基因表达明显减少并与ＨＩＦ２α基因表达相一致［１０］。研究发现大鼠ＨＩＦ１α和ＨＩＦ２α分别表达于不同的细胞系，ＨＩＦ１α主要表达于上皮细胞，而ＨＩＦ２α则主要表达于肾小管周围成纤维细胞和内皮细胞。肾成纤维细胞中表达ＨＩＦ２α则更支持其对ＥＰＯ的调控作用［１１］。正常氧浓度下转录因子转录因子（ＧＡＴＡ２）和ＮＦκＢ可与ＥＰＯ启动子结合从而抑制ＥＰＯ基因转录。而在炎症状态下，ＧＡＴＡ２和ＮＦκＢ均可抑制ＥＰＯ基因表达［１２］。尿毒症也是一种炎症状态，故ＧＡＴＡ２和ＮＦκＢ可能也参与了尿毒症患者ＥＰＯ表达的调控。ＥＰＯ缺乏与肾性贫血　在一定的条件下ＥＰＯ分泌可明显增加，它主要反应组织内供氧浓度的变化。贫血主要通过增加红细胞生成进行代偿，因此ＥＰＯ的浓度与血液中血红蛋白（Ｈｂ）的变化呈负相关。严重贫血患者血清ＥＰＯ水平可增加至正常的１０００倍。慢性肾功能衰竭（ＣＲＦ）贫血发生的主要原因仍然是ＥＰＯ的绝对和相对缺乏。无论贫血的轻重，大多数ＣＲＦ患者的ＥＰＯ合成均受损。部分ＣＲＦ患者体内ＥＰＯ水平正常或升高，但与其贫血程度相比仍低于正常。Ｆｅｈｒ等［１３］从５０００例冠状动脉造影术患者中随机选择了３９５例进行观察，发现肌酐清除率（Ｃｃｒ）＞４０ｍｌ／ｍｉｎ患者中Ｈｂ水平与ＥＰＯ浓度成负相关，但在肌酐清除率Ｃｃｒ＜４０ｍｌ／ｍｉｎ患者，ＥＰＯ浓度仍无明显升高。ＣＫＤ患者ＥＰＯ浓度显著低于正常的原因仍不清楚。理论上，可能是由于ＥＰＯ合成细胞的数量减少，或因为ＥＰＯ合成细胞在Ｈｂ降低时仍有高浓度氧供，或局部供氧和ＥＰＯ合成关系发生改变。研究提示，ＣＫＤ患者肾脏缺氧或氧利用障碍是导致肾脏病进展的重要原因，故肾脏ＥＰＯ合成减少并不是由于缺少低氧的刺激。但另一方面，也有研究发现采用ＨＩＦ降解抑制剂可促进ＣＫＤ患者ＥＰＯ的合成，这也证实ＣＫＤ患者ＥＰＯ合成能力并无下降［１４］。其它　尿毒症可引起红细胞破坏增加，并可能抑制红细胞生成。多个研究发现尿毒症患者存在明显溶血，从而导致红细胞寿命明显缩短。不同的研究提示尿毒症患者红细胞寿命仅为正常人一半左右，可能与尿毒症患者血浆可抑制红细胞膜ＡＴＰ酶的活性，导致膜的流动性和代谢功能受损从而缩短红细胞的寿命［１５］。血液透析（ＨＤ）可明显改善尿毒症患者的贫血，推测尿毒症血液中可能有抑制红细胞生成的毒素。开始常规透析后，尽管内源性血清ＥＰＯ水平明显降低，但红细胞压积却明显增加，提示ＨＤ清除了某种骨髓抑制因子［１６］。因此，充分透析是使用重组人红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）治疗透析患者肾性贫血的关键。肾性贫血也常与缺铁有关。透析患者每年丢失１～３ｇ元素铁，另外肠粘膜铁吸收减少和铁的贮存·１７１·肾脏病与透析肾移植杂志　第１６卷　第２期　２００７年４月　也明显减少。缺铁是导致ＥＰＯ治疗初期疗效差最主要原因，也会导致ＥＰＯ长期治疗失败。另外，ＥＰＯ治疗反应不佳也与功能性铁缺乏有关，即可利用铁不能满足红细胞生成的需要。而尿毒症的炎症状态可引起血循环中细胞因子增加，从而活化网状内皮系统的巨噬细胞吞噬并储存铁导致功能性铁缺乏。细胞因子尤其是ＩＬ１β和肿瘤坏死因子α还可减少内源性ＥＰＯ的合成并降低红系祖细胞对ＥＰＯ的反应［１７］。其它一些因素如继发性甲状旁腺功能亢进、铝中毒、肉（毒）碱缺乏也参与了肾性贫血的发生有关。促红细胞生成类的治疗药物重组人促红细胞生成素　ＥＰＯ是哺乳动物调节红细胞生成的主要因子，产生于肾脏（９０％）及肝脏，它的基本生理功能是刺激骨髓红细胞的生成和释放。１９７７年，人们首次成功地从再生障碍性贫血患者尿中纯化了少量ＥＰＯ，１９８３年成功分离和克隆了ＥＰＯ基因，并采用基因工程技术在中国仓鼠卵巢细胞中大规模生产ｒＨｕＥＰＯ，并于１９８９年（美国）和１９９０年（欧洲）应用于临床治疗肾性贫血。ｒＨｕＥＰＯ治疗ＣＲＦ和透析患者的贫血已取得了良好的效果。研究表明ＣＲＦ和ＨＤ患者使用ｒＨｕＥＰＯ后病死率明显低于未使用者［１８］。ＣＲＦ患者接受ｒＨｕＥＰＯ治疗后贫血得到纠正，从而避免输血，生活质量和耐受力均明显改善。贫血患者心脏代偿能力有赖于增加心率、左室收缩来增加心排血量，引起心脏左室肥厚及其他心血管并发症，并形成恶性循环。ＥＰＯ治疗可逆转ＣＲＦ患者的左心室肥厚，减少心力衰竭的发生及降低住院天数，并可以显著减少心血管事件的发生率［１９］。心血管疾病是ＣＲＦ最常见的死因，贫血纠正后ＣＲＦ患者心血管事件发生率和死亡率均明显下降。ＥＰＯ生物仿制药　２００２年Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ等［２０］在１３例使用ｒＨｕＥＰＯ后发生获得性纯红细胞再生障碍性贫血患者血清中检测出抗ｒＨｕＥＰＯ和内源性ＥＰＯ抗体。人们开始关注ｒＨｕＥＰＯ的不良反应，并对生物仿制药物生产制定了严格的准入规范。由于这一原因，多家制药公司放弃ＥＰＯ生物仿制药（ＢｉｏｓｉｍｉｌａｒＥｐｏｅｔｉｎｓ）研究生产，现仅有数家公司仍在进行研究开发。ＥＰＯ生物仿制药促进红细胞生成控制贫血的疗效肯定，但制药公司和管理者面对最大困难仍是这些药物的免疫源性。市场上所有ＥＰＯ产品均有发生纯红细胞再生障碍性贫血的报道，但发生率仍然非常低（约为１∶１００００）。新的ＥＰＯ生物仿制药进入临床后，仍需认真做好临床监察，注意有无获得性纯红细胞再生障碍性贫血的发生。持续性ＥＰＯ受体活化剂　持续性ＥＰＯ受体活化剂（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＣＥＲＡ）是可能得到批准下一个促进红细胞生成并治疗肾性贫血的药物，现已完成Ⅲ期临床实验。ＣＥＲＡ是将一个３０ｋＤ多聚体整合入ＥＰＯ分子，产生的两倍于ＥＰＯ分子量（６０ｋＤ）的复合物，体内的半衰期约为１３０ｈ。Ⅱ、Ⅲ期临床试验结果证实ＣＥＲＡ可３～４周给药一次，并且安全有效［２１］。每月给药一次对无需透析的ＣＫＤ患者更为合适方便，但这些结果尚未得到严格的同行鉴定。体外研究将ＣＥＲＡ和ＥＰＯβ对人急性髓细胞样白血病细胞系（ＵＴ７）ＥＰＯ受体表达进行了比较，ＥＰＯβ比ＣＥＲＡ可刺激更多ＵＴ７细胞增殖。而ＣＥＲＡ比ＥＰＯ更能有效的促进小鼠骨髓前体细胞和网织红细胞的增生，ＣＥＲＡ治疗组网织红细胞为１４％，而ＥＰＯ治疗组仅９％［２２］。现已在动物体内完成了皮下或静脉注射ＣＥＲＡ药效学和药物代谢动力学的临床前期研究，结果提示ＣＥＲＡ较ＥＰＯ清除率低，半衰期长，并随后在健康志愿者和ＣＫＤ患者中得到证实。Ⅲ期临床研究主要观察ＣＥＲＡ对透析和非透析ＣＫＤ患者贫血的治疗作用，结果证实ＣＥＲＡ较ＥＰＯ给药频率减少，疗效确切，患者耐受性好，无意外发生，至目前为止，受试者血中未检出抗ＣＥＲＡ抗体。Ｈｅｍａｔｉｄｅ　Ｈｅｍａｔｉｄｅ可能是第一种用于临床的肽基ＥＰＯ。１０年前，人们发现一组肽类家族成员在体内和体外与ＥＰＯ有类似的活性。它们与ＥＰＯ的结构并不相同，但可与ＥＰＯ受体相结合，并激活细胞内信号系统ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５。第一种与ＥＰＯ作用相似的肽（ＥＭＰ１）是一种环状低聚肽，其氨基酸序列与天然或重组ＥＰＯ结构完全不同，但其多种功能及生物学作用与ＥＰＯ相同，即与ＥＰＯ竞争结合受体，在２个不同的体内试验中均可诱导红细胞生成。此外，它能诱导与ＥＰＯ相似的细胞内酪氨酸磷酸化［２３］。另一种新的二聚体肽（ｈｅｍａｔｉｄｅ）在大鼠和猴体内半衰期长，促红细胞生成的时间也延长。体外研究表明Ｈｅｍａｔｉｄｅ与抗ＥＰＯ抗体无交叉反应，也·２７１·ＪＮｅｐｈｒｏｌＤｉａｌｙＴｒａｎｓｐｌａｎｔ　Ｖｏｌ．１６　Ｎｏ．２