HPLC法在国内外药典中的应用与比较

HPLC法在国内外药典中的应用与比较山东省药品检验所化学药品科王小兵2019/8/18山东省药品检验所2汇报的主要内容一、简述二、高效液相色谱仪三、系统适用性四、色谱条件的调整五、HPLC的应用及方法开发2019/8/18山东省药品检验所3一、简述《中国药典》2010年版二部共收载2271个品种，新增品种330个，修订品种1500个，涉及HPLC检测项目的品种有1291个，占总品种的57%，其中新增/修订926个。HPLC法在整个药典品种的检验中占有重要地位。2019/8/18山东省药品检验所4HighPerformanceLiquidChromatography简称HPLC，开始应用于20世纪60年代后期，现已趋于成熟，广泛应用于医药、生化、天然产物主要组分分析，以及食品、化妆品分析，环境分析，农业分析，石油化工分析等。优点：高压+高速+高效+高灵敏度一、简述2019/8/18山东省药品检验所5CHP(2010)：《中国药典》2010年版USP：UnitedStatedPharmacopoeiaEP：EuropeanPharmacopoeiaJP：JapanesePharmacopoeia一、简述2019/8/18山东省药品检验所6定义CHP(2010)附录VD：HPLC系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。USP(32)621：High-pressureliquidchromatography(HPLC),sometimescalledhigh-performanceliquidchromatography,isaseparationtechniquebasedonasolidstationaryphaseandaliquidmobilephase.Separationsareachievedbypartition,adsorption,orion-exchangeprocesses,dependinguponthetypeofstationaryphaseused.2019/8/18山东省药品检验所7定义EP(6.0)2.2.29：Liquidchromatographyisamethodofchromatographicseparationbasedonthedifferenceinthedistributionofspeciesbetweentwonon-misciblephases,inwhichpercolatesthroughastationaryphasecontainedinacolumn.2019/8/18山东省药品检验所8定义JP(XV)2.01：Liquidchromatographyisamethodtodevelopamixtureinjectedintoacolumnpreparedwithasuitablestationaryphasebypassingaliquidasamobilephasethroughthecolumn,inordertoseparatethemixtureintoitscomponentsbymakinguseofthedifferenceofretentioncapacityagainstthestationaryphase,andtodeterminethecomponents.2019/8/18山东省药品检验所9二、高效液相色谱仪基本组成：2019/8/18山东省药品检验所10泵CHP(2010)USP(32)EP(6.0)JP(XV)未解释满足等度和梯度洗脱;压力：5000psi或更高;最大可达10ml/min可满足等度或梯度洗脱只强调了恒定速率泵的种类很多，目前应用最多的是柱塞往复泵（恒流泵）2019/8/18山东省药品检验所11进样器CHP(2010)USP(32)EP(6.0)JP(XV)未解释微量进样器定量环自动进样器手动/自动强调重复性好即可2019/8/18山东省药品检验所12色谱柱—分离的核心CHP(2010)附录：1.正相：硅胶柱；反相：C-18柱、C-8柱；2.粒径：普通3～10μm；2μm（亚-2μm仅能用于UPLC）；3.温度要求：以硅胶为载体的通常40℃；不宜超过60℃；4.pH要求：2～8；2，化学键合相脱落8，硅胶溶解以5μm最为常见2019/8/18山东省药品检验所13色谱柱技术发展很快，新填料新技术也不断涌现，给我们提供了更多的选择。Gemini-NXC18柱：色谱柱乙烷交联，抵抗高pH侵蚀多点配体键合，抵抗低pH下配体水解pH1~12稳定！KinetexC18柱：通过核-壳颗粒技术，使颗粒减小到2.6μm，而无需高压即可达到提高速度、分离度和灵敏度的效果。2019/8/18山东省药品检验所14色谱柱ZorbaxStableBond柱：采用了较大的二异丁基(SB-C18)或二异丙基(SB-C8、SB-C3、SB-Phenyl、SB-CN、SB-Aq)侧链基团和空间位阻，避免了在低pH条件下的水解破坏，其pH1.0~8.0，温度上限也可达到80~90℃，甚至在100%水相中也有出色的表现。2019/8/18山东省药品检验所15色谱柱ZorbaxExtendC18柱：采用独特的双配位C18-C18键合技术，使的在高pH条件下使用硅胶基色谱柱成为可能，在pH2~11.5的范围内是稳定的。2019/8/18山东省药品检验所16USP(32)621:Stationaryphasesformodern,reverse-phaseliquidchromatographytypicallyconsistofanorganicphasechemicallyboundtosilicaorothermaterials.1.Particles：usually3to10mindiameter；mayrangeupto50mormoreforpreparativecolumns.2.Internaldiameters：usually2to5mmforanalyticalseparation，lagerforpreparativechromatography.3.Temperature:onlyrarelyabove60℃；4.根据填料不同，USP在ChromatographicreagentsintheReagents,Indicators,andSolutionssection列出了USP-NF所用到的不同类型的柱子，如下所示:C-18硅胶柱C-8NH2柱阳离子交换柱（SCX）CN柱苯基柱阴离子交换柱（SAX）L57~L67未列出2019/8/18山东省药品检验所19EP(6.0)2.2.29：大部分分离机制都是基于以化学键合硅胶作为固定相，极性溶剂作为流动相的色谱条件。而化学键合相的性质往往决定了色谱系统的分离性能。2019/8/18山东省药品检验所20particlesize：3~10μminternaldiameters：prescribedinthemonograph,eg:pH：silicabasedreversed-phasecolumnsareconsideredtobestableinmobilephaseshavinganapparentpHintherange2.0to8.0.temperature:notbeheatedabove60℃Special：EP(6.0)2.2.29：stationaryphasedegradetioncompositionofthemobilephase2019/8/18山东省药品检验所21EPMannitolAssay:2019/8/18山东省药品检验所22JP(XV)：Acolumnwithastationaryphasechemicallyboundontheinsidewallinsteadofthecolumnpackedwiththepackingmaterialmaybeused.2019/8/18山东省药品检验所23检测器CHP(2010):UVDADFLDECDELSDRIDMS优点：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、对流速和温度的波动不灵敏，适用于梯度洗脱及制备色谱。缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的选择有一定限制，流动相的截止波长必须小于检测波长。适用范围：大多数有紫外吸收的化合物。优点：通用型检测器，对各种物质有几乎相同的响应。缺点：灵敏度相对较低，流动相必须是挥发性的，不能用非挥发性的缓冲盐及表面活性剂。适用范围：适用于挥发性低于流动相的组分，主要用于糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯、皂苷及甾体等等无紫外吸收或紫外末端吸收的化合物的检测。优点：灵敏度高、选择性好，是微量组分和体内药物分析常用的检测器之一。缺点：只适用于能够产生荧光的物质的检测，适用范围不如紫外检测器。影响因素较多。适用范围：具有天然荧光的物质或通过荧光衍生化变成荧光衍生物后测定，主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。优点：灵敏度很高，尤其适用于痕量组分分析。缺点：干扰比较多，对温度和流速的变化比较敏感。适用范围：应用范围广，凡具氧化还原活性的或经衍生化后具氧化还原活性的物质。优点：灵敏度高，选择性好，能同时给出组分的结构信息。缺点：响应信号受离子化效率限制，仪器较为昂贵，流动相必须是挥发性的，不能用非挥发性的缓冲盐及表面活性剂。适用范围：组分的结构鉴别，微量及痕量组分的分析，药物代谢分析等。优点：通用型检测器，只要组分的折光率与流动相的折光率有足够的差别就能检测。缺点：灵敏度低、受环境温度、流量及流动相组成等波动的影响大，一般不能用于梯度洗脱。适用范围：RID为通用型检测器，适用于无紫外吸收化合物的分析，如糖类分析。2019/8/18山东省药品检验所24USPandEPUSP(32)EP(6.0)Fixed,variableandmulti-wavelengthdetectorsarewidelyavailable.UV、RID、FLD、ECD......Newdetectorscontinuetobedevelopedinattemptstoovercomethedeficienciesofthosebeingused.UV/Visspectrophotometers,includingdiodearraydetectors,arethemostcommonlyemployeddetectors.2019/8/18山东省药品检验所25流动相CHP(2010)反相系统首选甲醇-水系统（采用紫外末端波长检测，首选乙腈-水系统）缓冲盐：少用，尽可能低反相色谱系统，C-18柱，有机相比例应不低于5%。USP(32)High-purityreagentsand“HPLCgrade”organicsolventswater:lowcondutivityandlowUVabsorptionEP(6.0)Fornomal-phasechromatography,lesspolarsolventsareemployed.Wateristobestrictlycontrolled!0.45μmdegassedbysparingwithhelium,sonicationorusingon-linemembrane/vacuumAdjustmentofthepH,iseffectedusingonlytheaqueouscomponentofthemobilephaseandnotthemixture.2019/8/18山东省药品检验所26系统适用性SystemSuitability2019/8/18山东省药品检验所27定义CHP(2