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产脂肪酶菌株分离鉴定一实验目的从样品分离纯化出能够产生脂肪酶的微生物菌株二实验原理脂肪酶(Lipase，EC3．1．3)也叫三酰甘油脂水解酶，是一类重要的酯键水解酶，能够在油一水界面上催化天然油脂(甘油三脂)生成游离的脂肪酸、甘油和甘油单酯或甘油二酯，广泛存在于动物、植物和微生物．相对于动、植物脂肪酶，微生物脂肪酶具有生产成本低，易分离提纯且应用广泛，对金属离子、有机溶剂、表面活性剂的耐受性强，易于进行工业化生产等特点，使得微生物脂肪酶继淀粉酶、蛋白酶后再次掀起酶工业化应用的热潮在产脂肪酶微生物中，细菌脂肪酶尤其是假单胞菌属菌株所产脂肪酶被研究得最多J最近几十年，随着工业化应用对脂肪酶性质的不同需求，能够产生具有特定酶学性质的脂肪酶的微生物种类不断增加，目前遍及酵母菌属、霉菌属等引.本实验从富含油脂的样品中筛选到一株产脂肪酶的真菌脂肪酶(LipaseEC3.1.1.3)是一类特殊的酯键水解酶，它可以在油(或脂)—水界面上将油脂水解成甘油和脂肪酸，在微生物及动植物体内普遍存在。随着对微生物脂肪酶的研究，目前已发现多种具有不同的酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景[1,2]。脂肪酶广泛应用于食品加工及风味改革、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、化妆、洗涤、医药、能源等领域[3,4]。近年来随着化石资源的枯竭，能源危机越演越烈，生物柴油作为可再生的绿色能源得到了人们的广泛关注。目前用于制备生物柴油的脂肪酶主要有Novozyme435和假丝酵母,无根根霉,青霉,等微生物脂肪酶[5,6]，但针对麻疯树油为主要原料酶法生产生物柴油的脂肪酶尚少见报道。此外，在酶法生产生物柴油过程中，脂肪酶对有机相的耐受性及其自身的稳定性也较差[8]。本研究从以粉碎的麻疯树种子预处理半年的土壤中分离出一株脂肪酶活性较高的菌株，并进一步对其产酶条件进行了研究,为以麻疯树油为原料酶法生产生物柴油奠定一定基础。三实验步骤1材料与方法1.1材料1.1.1土样经过粉碎的麻疯树种子预埋处理半年的土壤。1.1.2培养基富集培养基(g/L)：酵母膏2.0，(NH4)2SO42.0，K2HPO43.0，MgSO4.7H2O1.0，麻疯树油乳化液50mL，pH7.2；分离培养基(g/L):(NH4)2SO42.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O1.0，RhodaminB0.01，麻疯树种子油20mL，初筛平板pH7.5；培养基（g/L）：聚蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl5.0，CaCl20.1，Tween8010ml,pH7.2；初筛液体发酵培养基（g/L）：酵母膏5.0，(NH4)2SO45.0，MgSO4.7H2O0.5，KH2PO42.0，NaCl3.0，麻疯树种子油20mLpH6.5；种子培养基(g/L):牛肉膏0.4，蛋白胨1.0，NaCl5.0，MgSO4.7H2O0.5，麻疯树油20mL，自然pH；复筛液体发酵培养基同初筛液体发酵培养基。1.2方法1.2.1富集培养取6g土样与40mL无菌水混合，180r/min振荡30min，取5mL上清液加到富集培养基中，于30℃、180r/min条件下培养48h后取15mL转接入60mL新鲜的富集培养基中，连续转接3次。1.2.2脂肪酶产生菌的分离将经富集培养的菌液适当稀释后涂布接种于用以麻疯树油为唯一碳源的分离培养基上，于35℃培养48h后挑取透明圈和荧光圈较大的单菌落于营养琼脂培养基划线纯化后，用无菌牙签接种于Tween80平板上35℃培养48h，菌落周围出现模糊晕圈，直径较大的菌株酶活较高1.2.3摇瓶初筛将经Tween80平板初筛得到的细菌接种于50ml摇管中（内含20ml初筛液体发酵培养基），于35℃、振荡培养40h，转速180r/min，取50μL发酵液加入到打孔的鉴别平板（培养基同分离培养基）中，于35℃培养48h后测定荧光圈的有效直径，保留直径大的菌株进行摇瓶复筛。1.2.4摇瓶复筛将摇瓶初筛得到的菌株接种于种子培养基中培养24h，接种于30mL复筛培养基中，接种量10％，于35℃、180r/min条件下振荡培养36h，测定脂肪酶活性。1.2.5菌种鉴定产脂肪酶菌株的形态学观察及生理生化实验参照文献[9]和[10]。四结果分析参考文献[1].JaegerK-E,DijkstraBW,ReetzMT.AnnuRevMicrobiol,1999,53:315[2].ArpignyJL,JaegerK-E.BiochemJ,1999,343:177[3].施巧琴.碱性脂肪酶的研究[J].微生物学通报,1981,8(3):108-110[4].彭立凤,赵汝淇,谭天伟.微生物脂肪酶的应用[J].食品与发酵工业,2000,26(3):68-79.[5].邓利,谭天伟,王芳.脂肪酶催化合成生物柴油的研究[J].生物工程学报，2003,19(1):97-101.[6].唐良华,苏敏,薛建平等.Penicilliumsp.脂肪酶的发酵及催化生成生物柴油的研究[J].生物技术.2006,16(5):67-70[8].汪勇,欧仕益,温勇等.酶法催化合成生物柴油的研究进展[J].中国油脂.2006,31(1):65-68[9].东秀珠,蔡妙英登.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.[10].HoltJG,KriegNB,SneathPH,etal.Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology.9thed[M].BaltimoreWilliamsandWilkinsPress,1994.151