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重组人胰岛素的研究历史和生产工艺——BY:王腾时佳孙玉新玛依努尔据世界卫生组织统计，2011年全球糖尿病患者2.8亿，在中国，已突破9200万人，发病率达10%，同时由于老龄化等因素，国内还有9000多万的潜在糖尿病患者。加之中国糖尿病患者整体治疗率不足三成，且人均胰岛素使用量偏低，仅为美国糖尿病患者人均使用量的0.8%，所以中国胰岛素市场潜力巨大。重组人胰岛素胰岛素定义：胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素结构：胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。猪胰岛素牛胰岛素赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins）门冬胰岛素（诺和诺德公司、速效Ins）甘精胰岛素(安万特公司、长效Ins)人胰岛素原B30A8;A10;B30B28;B29B28A21;B31;B323DStructureofInsulin胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer）Ins的性质1.Mw：5700左右pI：5.3～5.352.溶解度Ins在pH4.5~6.5范围内几乎不溶于水，在乙醚中不溶，在90％以上乙醇或80％以上丙酮中难溶。易溶于稀酸或稀碱溶液，在80％以下乙醇中也可溶解。3.在溶液中的状态胰岛素的锌盐在pH2呈二聚体，随pH升高，聚合作用增强在pH4～7时，聚合成不溶解状态的沉淀pH9时解聚并失活4.稳定性Ins在弱酸性水溶液中或混悬在中性缓冲液中较稳定还原剂及多种重金属使Ins失活紫外线、光氧化、超声波会引起Ins变性。胰岛素的功能•稳定性•Ins在弱酸性水溶液中或混悬在中性缓冲液中较稳定•还原剂及多种重金属使Ins失活•紫外线、光氧化、超声波会引起Ins变性。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。药理作用治疗糖尿病、消耗性疾病。1921年----从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。1926年----重结晶胰岛素1930s----传统中、长效动物胰岛素1970s----单峰胰岛素和单组分胰岛素70年代末----半合成胰岛素重组胰岛素的研究历史1982年----采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。1998年，成功研制出了中国第一支基因重组人胰岛素制剂“甘舒霖”90年代至今----重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。基因重组人胰岛素研制成功基因重组人胰岛素实验中国胰岛素市场状况放眼全球，胰岛素作为最重要的糖尿病治疗药物，在过去5年中取得了14%的复合增长率，2010年已达到145亿美元的销售额。但胰岛素市场高度集中于三巨头诺和诺德、礼来和赛诺菲安万特，三家公司占全球胰岛素90%以上的市场份额。目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。动物来源的胰岛素（28种）2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。半合成来源的胰岛素（5种）3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。基因重组来源的胰岛素（27种）基因重组来源的胰岛素（27种）药品名称生产企业药品名称生产企业APIDRASANOFIAVENTISUSLANTUSSANOFIAVENTISUSEXUBERAPFIZERLEVEMIRNovoNordiskHUMALOGLILLYMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSHUMALOGMIX50/50LILLYNOVOLIN70/30NovoNordiskHUMALOGMIX75/25LILLYNOVOLINLNOVONORDISKINCHUMALOGPENLILLYNOVOLINNNOVONORDISKINCHUMULIN50/50LILLYNOVOLINRNOVONORDISKINCHUMULIN70/30LILLYNOVOLINR（Purified）NOVONORDISKINCHUMULIN70/30PENLILLYNOVOLOGNOVONORDISKINCHUMULINBRLILLYNOVOLOGMIX70/30NOVONORDISKINCHUMULINLLILLYVELOSULINBRNOVONORDISKINCHUMULINNLILLYVELOSULINBRHUMANNOVONORDISKINCHUMULINRLILLYHUMULINULILLYHUMULINRPENLILLY胰岛素给药方式的发展一种新的注射给药方式:NIS泵通过一条与人体相连的软管向体内持续输注胰岛素的装置。它模拟人体健康胰腺分泌胰岛素的生理模式。俗称“人工胰腺”。维持血液中INS水平缩短控制高血糖的时间减少低血糖发生，减轻病人多次皮下注射INS的痛苦INS泵是强化治疗的最佳手段口服给药：由于采用了包裹的方法来保护胰岛素制剂，口胰岛素在胃及小肠内不被破坏，在大肠内分解、释放出来，通过肠黏膜进行吸收。肺部给药：巨大的肺泡表面积、极薄的肺泡、丰富的毛细血管网、狭小的气血通路、低酶活性、肺深处较慢的清除速率等，这些良好的生理环境为蛋白多肽的吸收提供了有利条件。眼部给药：INS主要通过眼结膜和鼻泪管黏膜吸收进入体循环两达到降糖效果。一般眼内容量少，INS作用时间短，生物利用度低．因此人们致力于研究能延长INS作用时间的滴眼剂，并选择刺激性小的滴眼剂。鼻腔给药黏膜内血管丰富．黏膜上蛋白酶含量也比胃肠道中少，减少了INS被酶破坏失活。提高了药物的生物利用度。许多药物动力学研究表明，鼻黏膜吸收INS的机制与体内内源性的INS释放极为相似，为鼻腔INS给药提供了理论依据。鼻腔给药需要加入吸收促进剂才能增加吸收效果口服给药、局部给药……人胰岛素分类•传统中长效胰岛素•长效人胰岛素类似物•速效人胰岛素类似物•非注射胰岛素速效胰岛素特点：•起效快，皮下注射后15分钟起效。•达峰快，注射后15分钟起效，30～60分钟达到药效高峰。•药效维持时间短，大约在3小时左右（2～4小时）。药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似，能够很好地控制当餐后血糖而且不容易发生低血糖。起效时间达峰时间峰持续时间作用消除时间常规皮下Ins:30-90min1.5-2.5h2-4h6-8h生理Ins：0-20min30-45min2-3h3-4hLispro（赖脯胰岛素，Humalog®）是第一个用于临床的速效胰岛素类似物,由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的B28与B29位的氨基酸对换。。Aspart（门冬胰岛素，Novolog®）由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了B链28位上的脯氨酸。APIDRA（赖谷胰岛素，Apidra®）安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的天冬氨酸和B29位的赖氨酸。长效胰岛素-人胰岛素类似物1.甘精胰岛素（glargine）：商品名Lantus®------甘氨酸替代胰岛素A链21位门冬氨酸、并在B链末端增加两个精氨酸。使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使等电点由5.4上升至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性条件下结晶。2.InsulinDetemir：商品名Levemir®------胰岛素B链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基酸的14碳游离脂肪酸●该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰期。InsulinDetemir（Levemir®）诺和诺德公司研制glargine（Lantus®）安万特公司研制胰岛素肺部吸入制剂--------Exubera●辉瑞、万安特以及Nektar共同研发●于2006.1.27被FDA批准●一种作用快的胰岛素干粉吸入剂●适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有速效化的特征胰岛素制备工艺以动物胰脏为原料提取胰岛素----酸醇提取法半合成胰岛素----以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组DNA技术生产人胰岛素※AB链合成：分别表达AB链，化学方法连接※逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素重组DNA技术制造人胰岛素1.AB链合成法：以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融和基因，分别在大肠杆菌中表达A链和B链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。————已被淘汰2.反转录酶法：仿照天然合成途径通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。InsA链InsB链转化大肠杆菌发酵A链B链纯化二硫键活性胰岛素AB链合成人胰岛素质粒InsmRNA反转录InscDNA转化大肠杆菌PCR连接胰岛素原活性胰岛素二硫键酶切提取质粒限制性内切酶酶切反转录酶法合成人胰岛素离子换，分子筛色谱，反相色谱结晶CNBr裂解，去除保户多肽发酵胰岛素原融合蛋白胰岛素原（SSO3）粗品亚硫基化胰岛素原纯化胰岛素原纯品酶切解离A,B链胰岛素粗品纯化的人胰岛素基因重组大肠杆菌生产重组人胰岛素工艺流程破碎菌体包涵体尿素溶解复性酵母系统生产重组人胰岛素的工艺流程发酵菌种摇瓶种子培养种子罐培养生产罐发酵微小胰岛素原溶液离心除去菌体超滤、离子交换吸附沉淀纯化的胰岛素原胰岛素粗品胰酶和羧肽酶处理离子交换色谱、分子筛色谱、二步反相色谱重结晶、胰岛素纯品酵母系统生产重组胰岛素优点：二硫键的结构与位置正确，不需要复性加工处理缺点：表达低，发酵时间长表达载体结构基因组成：信号肽、前肽序列、MCS和微小胰岛素原。前肽序列引导目的蛋白通过正确的分泌途径至胞外。宿主：贝克酵母。分泌量大，形成二硫键，培养基简单，高密度发酵，无热原和有毒物质发酵生产重组人胰岛素设备重组胰岛素的质量控制–测定生物活性–效价测定–控制产品中杂质或潜在有害物质–保证产品安全性和有效性长期重复大剂量使用1.通化东宝1998年12月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖”甘舒霖®R--常规重组人胰岛素注射液甘舒霖®N--低精蛋白重组人胰岛素注射液甘舒霖®30R--30/70混合重组人胰岛素注射液（30%常规重组人胰岛素和70%低精蛋白重组人胰岛素）2.深圳科兴苏泌啉--常规重组人胰岛素注射液苏泌啉恩--低精蛋白重组人胰岛素注射液3.徐州万邦万邦林--常规重组人胰岛素注射液万苏林—猪胰岛素制剂胰岛素国内主要生产厂家其他（持有药品注册证）---南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化制药厂、武汉生化制药厂等