重组蛋白的分离纯化

1.原核体系2.真核体系遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)苏云金杆(Bacillusthuringiensis)酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞/组织植物细胞/组织可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;商品化表达体系：酿酒酵母（Saccharomycecerevisiae）;毕赤酵母(Pichiapastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomycepombe）可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本较高分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，实验周期长分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；实验成本低，饲养费用低；加糖方式可能与人有所不同植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不方便研究基因功能:大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:杂交瘤细胞工业酶生产:各种微生物重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。等电点处于极端区域（pI≤5或pI≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8-10-4mol/L）；疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉PreparationofthebacteriallysateItisacriticalstep.Optimalconditionsmaximizecelllysisandthefractionoftherecombinantproteinthatisextractedwhileminimizingproteinoxidation,unwantedproteolysisandsamplecontaminationwithgenomicDNA.Thelysisbuffershouldcontainastrongbuffertoovercomethecontributionofthebacteriallysate,highionicstrengthtoenhanceproteinsolubility,proteaseinhibitorsandareducingagentsuchasTECPtopreventoxidationoftheprotein.Aboutgelfiltration•ThechoiceofgelfiltrationasthenextstepafterIMACmaybesurprising,consideringitslowerresolvingpowercomparedwithionexchangeorotheradsorptionchromatographymethods,butthisstepisoftensufficientafterIMACiftheproteinwasabundantinthelysate.•Moreover,gelfiltrationismoregeneric,canbeperformedinanybuffercondition,andcanbeusedtoresolvetheoligomerizationstateofthetargetprotein.•Superdex75andSuperdex200prepgrade,XK16/60columnsaremostusefulfor1-30mgofproteininasamplevolumeofupto7.5ml.要分泌的多肽有一个疏水的氨基突出，它负责向内质网的转运这个末端突出通常由大约20个氨基酸组成，并且在内质网中从成熟蛋白上剪切下来。人们已经利用含有合适重组质粒的酵母细胞分泌了大量的非酵母多肽，而且绝大多数情况下都用到了a-因子信号序列。外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入15～30个氨基酸组成的信号肽（signalpeptides）序列。信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：①分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。②分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。③简化了发酵后处理的纯化工艺。缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。1、重组载体的构建特导引物设计，以pBV220-ALR质粒为模板扩增目的条带构建酵母表达重组质粒，转化毕赤酵母GS115重组蛋白的表达及鉴定rhALR的纯化菌液上清经低盐透析后，超过DEAE-SepharoseFF柱的饱和吸附量上样，洗脱组分脱盐后再上DEAE-SepharoseFF柱，然后再用SephadesG-75柱进一步纯化。离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的SepharoseCL-6BDEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积。离子交换介质的选择原则对pI=5的某酸性蛋白质当蛋白质为阴离子时，在pH5.5-9.0的范围内，应首选DEAE纤维素；当蛋白质为阳离子时，在pH3.5-4.5的范围内，应首选CM纤维素12346789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂pHpI（+）pH=pI（0）pHpI（-）Whathappensinionexchange?sampleapplicationandwashelutionequilibrationregeneration-----------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------anionexchangerbead++++++-------equilibrationanionexchangerbead--------++++++----sampleapplicationandwash----------------------------++++++++++++--elution-----------------------++++++regeneration离子交换层析的基本操作层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要离子交换层析的基本操作样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数离子交换层析的基本操作样品洗脱恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱102030405060708090分子浓度离子强度pH值色谱条件：DEAE-SepharoseFF阴离子交换填料；XK26/20色谱柱，体积89.32ml;8ml/min;0.2灵敏度A液：5ommol/LTris-Hcl(pH8.0)B液：50mmol/LTris-Hcl+1mol/NaCl(pH8.0)以A液为平衡液，B液为100%洗脱液，各洗脱浓度由PharmaciaFPLC系统自动将A液和B液混合产生。阴离子交换层析：透析上清超过饱和吸附量上样后，目的蛋白主要集中在0.1mol/LNaCl洗脱峰，但还含有很多杂质；在1mol/LNaCl洗脱峰中只存在少量目的蛋白超饱和上样的0.1mol/LNaCl洗脱峰脱盐后再上样，目的蛋白集中在0.2mol/LNaCl洗脱峰，杂质含量已较少。凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的选用原则凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本原理凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度快分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。凝胶介质的基本性质葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温葡聚糖凝胶（Sephadex）SephadexLH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤凝胶介质的选用原则将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。组别分离一般选用SephadexG-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用SephadexG-10、G-组别分离15、Bio-GelP-2或P-4将样