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，周传光2，王艳洁2，林忠胜2，姚子伟2，徐恒振2，吕景才1，赵元凤11大连水产学院生命科学与技术学院，辽宁大连（116023）2国家海洋环境监测中心，辽宁大连（116023）E-mail：xuanqj2002@163.com摘要：本文采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法,对10种有机磷农药(OPPs)进行了分离和检测,对流动相、流速、紫外吸收波长、柱温等条件进行了优化，对方法的精密度和检测限进行了考查。结果表明除对硫磷和异稻瘟净、甲拌磷和二嗪农的色谱峰有重叠外,其他6种有机磷：速灭磷、水胺硫磷、杀扑磷、甲基对硫磷、马拉硫磷和杀螟松都得到了完全分离。该方法具有较好的精密度,最低检测限达0.15ng～0.62ng,批内偏差在2.91％～12.76％，适合于10种有机磷农药的分离测定。关键词：OPPs，RP-HPLC，分离，检测中图分类号：X551．引言有机磷农药是目前我国使用量较大的杀虫剂之一，毒性较大，已对人类健康造成了很大危害[1]，长期食用有机磷污染的粮食、蔬菜，会导致癌症、动脉硬化、心血管病等疾病。农残问题已被广泛关注，各国政府制定了相关法规，限制了农药的最大残留限量，其限量标准越来越低。因此，建立快速有效的有机磷农药残留量检测方法，具有重要意义。有机磷农药的测定常采用薄层色谱法[2]，气相色谱法[3~5]，气相色谱/质谱联用[6,7]及液相色谱/质谱联用。薄层色谱法由于其灵敏度不高而限制了其使用范围；气相色谱具有高选择性、高分离效能、高灵敏度和快速的特点，是有机磷残留量检测最常用方法之一，几乎全部采用火焰光度检测器检测有机磷，而一些实验室在气相色谱仪检测器选配上,较多选择了常用的热导检测器（TCD）、氢火焰检测器（FID）、电子捕获检测器（ECD），给有机磷的检测带来了一定的困难，且气相色谱法会使某些热不稳定性有机磷农药产生热分解，因而需要把有机磷衍生化，增加了分析过程的复杂性；带有电喷雾离子源的液质联用技术[8,9]可以直接分析有机磷农药，无需衍生化，并且液质联用技术在定性和定量方面都有很大的优点，可得到被测物的分子结构信息，但因仪器贵重，难以普及。高效液相色谱法检测有机磷以其公认的直接、快速、高效、简便和适用范围广等优点而得到迅速发展，适用于强极性、低挥发性和热不稳定的有机磷农药的分析，成为有机磷农药残留检测领域中的主要技术，一般只能同时测定1～3种有机磷[10~14]。本研究采用反相高效液相色谱分离测定有机磷农药，建立一种能同时检测10种有机磷农药的液相色谱分析方法。2仪器与试剂2.1仪器高效液相色谱仪：HITACHI-7100；检测器：紫外检测器（HITACHIL-7420）；1本课题得到国家高技术研究发展计划（863计划）项目(批准号：2006AA09Z164)的资助色谱柱：spherisorbODS2色谱柱（150mm×4.6mm,3µm）；微量进样针：50µL；2.2试剂与处理10种有机磷标准品：速灭磷、水胺硫磷、杀扑磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟松、对硫磷、异稻瘟净、甲拌磷、二嗪农，纯度＞99.0％（国家农药质检中心,沈阳)；甲醇：色谱纯；亚沸蒸馏水：在全石英亚沸水蒸馏器中，加入5g高锰酸钾和3L自来水，在水温未达到沸点的温度（变阻器电压小于70V下加热）下缓慢蒸馏，收集而得。3结果与讨论3.1流动相的选择表1为不同流动相对10种有机磷分离的影响。图1为波长在225nm时10种有机磷的标准色谱图。图1中标示的10种有机磷，是依据在一定的色谱条件下，相同物质具有相同保留值的原理而定性的，即由相应标准物质单体定性，分别为速灭磷、水胺硫磷、杀扑磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟松、对硫磷+异稻瘟净（二者重叠）、甲拌磷+二嗪农（二者重叠）。本实验用甲醇和水作流动相。流动相程序Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为恒梯度，其甲醇和水的比例分别80:20，70:30，65:35，60:40。流动相程序Ⅴ为梯度洗脱程序：在0min～2min内，甲醇保持在55％；在2min～3min内，甲醇由55％线性增加到67％；在3min～35min内，甲醇保持在67％；在35min～40min内，甲醇由67％线性递减到55％。以上5个流动相程序的流速皆为0.4mL/min。由表1看出，流动相程序Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分离较差，流动相程序Ⅴ较好，分离时间半小时左右即可（最后一个峰的保留时间为30.8min）。综合考察出峰数、保留值2个指标，以流动相程序Ⅴ作为分离测定10种有机磷的流动相程序为宜。表1不同流动相对有机磷分离的影响Tab.1Separationoforganophosphorousindifferentmobilephase流动相程序出峰数最后一个峰的保留时间(min)Ⅰ24.0Ⅱ610.1Ⅲ721.2Ⅳ526.5Ⅴ830.8种有机磷的标准色谱图（波长：225nm）Fig.1Thestandardchromatogramoftenorganophosphorous(wavelength:225nm)3.2检测波长的选择图2为在流动相程序Ⅴ在4个不同波长下的10种有机磷液相色谱图（图中，a、b、c、d4条谱带的检测波长分别为280nm、254nm、225nm、210nm，其有机磷进样浓度皆为10µg/mL，进样量均为10µL）；表2为同样条件下10种有机磷的出峰和响应值。由表2可以看出，当波长为254nm和280nm，有机磷紫外吸收值较小，甚至没有响应值（见图2中谱带a和b）；波长为210nm和225nm，有机磷保留值和分离度相似，具有较好的紫外吸收值，出峰全。考虑到波长为210nm基线漂移太大（见图2中谱带d）,选择紫外检测波长225nm（见图2中谱带c）。图24种不同波长的10种有机磷农药的液相色谱图Fig.2TheLiquidchromatogramoftenorganophosphorousatfourdifferentwavelengths表24种不同波长下10种有机磷的出峰及其响应值（单位:µv·s）Tab.2Thepeaksandresponsevalueoftenorganophosphorousatfourdifferentwavelengths280nm254nm225nm210nm有机磷名称出峰响应值出峰响应值出峰响应值出峰响应值速灭磷否0否0是173969是249028水胺硫磷是10314是9059是216926是315128杀扑磷否0是57293是215038是209890甲基对硫磷是289405是156468是182489是276722对硫磷+异稻瘟净是228501是117412是291029是471137甲拌磷+二嗪农否0是21871是127355是2061163.3流速的选择表3为流动相程序Ⅴ在不同流速下对有机磷的分离度及保留时间的影响(分离度的计算公式为：))(2/1()(wjwiijijttttR+−=，式中，Rij为峰i和峰j的分离度，ti为峰i的保留时间，tj为峰j的保留时间，twi为峰i的峰底宽度，twj为峰j的峰底宽度。表3中的数值6.62为速灭磷和水胺硫磷之间的分离度值，数值2.21为水胺硫磷和杀扑磷之间的分离度值，其它分离度值依次类推)。由表看出，当流速为1.0mL/min时，程序时间虽短，分离较好，但甲基对硫磷和马拉硫磷的分离度小于1.0；当流速为0.4mL/min时，程序时间过长，分离度大；当流速分别为0.8mL/min和0.6mL/min时，程序时间较短，所有峰都能分开，分离度相似，分离度最小值皆为1.0，而流速为0.6mL/min的程序时间较长。综合考虑保留值和分离度2项指标，选择流速为0.8mL/min。表3不同流速对有机磷分离度和保留时间（min）的影响Tab.3Separationandretentiontimeoforganophosphorousindifferentmobilephase0.4mL/min0.6mL/min0.8mL/min1.0mL/min有机磷名称分离度保留时间分离度保留时间分离度保留时间分离度保留时间速灭磷6.623.683.142.154.081.495.061.28水胺硫磷2.2110.274.004.762.673.502.892.78杀扑磷2.3413.272.667.282.645.212.874.19甲基对硫磷1.0415.671.039.611.057.130.975.80马拉硫磷2.6316.672.1810.402.277.892.266.52杀螟松4.0418.953.0812.113.329.233.337.72对硫磷+异稻瘟净3.0824.012.1015.672.0512.112.169.89甲拌磷+二嗪农28.5318.7314.1711.613.4柱温的选择表4为在流动相程序Ⅴ、波长225nm、流速0.4mL/min、进样浓度10µL/mL、进样量都为10µL条件下，考查了不同柱温(10℃、18℃、25)℃对保留时间及响应值的影响。由表可见，随着温度的增加，保留时间变小，但变化幅度不大，且温度改变与响应因子之间不呈明显的线性关系。选择柱温为室温20℃左右即可。不同柱温对保留时间(min)及响应值(单位:µv·s)的影响Tab.4ResponsevalueandretentiontimeoforganophosphorousatdifferentColumntemperature10℃18℃25℃有机磷名称保留时间响值值保留时间响值值保留时间响值值速灭磷3.801580043.741606903.45163506水胺硫磷11.0421692610.912165639.71219080杀扑磷13.9721503813.5921935512.93223868甲基对硫磷16.5418248915.9918836915.60181985马拉硫磷17.647588717.067899716.7375799杀螟松20.158588419.508791819.1390289对硫磷+异稻瘟净25.4829102925.0529939324.27306204甲拌磷+二嗪农30.1911603429.8111619828.751177683.5精密度和检测限表4为在流动相程序Ⅴ、波长225nm、流速0.4mL/min、进样浓度10µL/mL、进样量都为10µL条件下10种有机磷农药的精密度和最低检测限。10种有机磷农药的最低检测限在0.15ng~0.62ng之间[检出限计算公式为iinVCHHM⋅=min。式中Mmin为最低检出限，Hn为3倍噪音峰响应值（本方法反复测定后的3倍噪音峰响应值的均值为447µv·s），H为标样峰响应值（平均值，n=2），Ci为标样浓度，Vi为进样体积]。当日对同一样品连续进样3次，每次进样10uL，得批内偏差。隔日再对样品进行测定，得批间偏差。可以看出，10种有机磷农药的批内偏差在2.91％～12.76％之间，精密度较好，但批间偏差较大，在9.51％~64.79％之间，因此，有机磷样品不宜久放。表510种有机磷农药的精密度和最低检测限Tab.5Theprecisionanddetectionlimitsoftenorganophosphorouspesticides有机磷农药名称批内偏差（％）批间偏差（％）峰响应值（µv·s）最低检测限（ng）速灭磷6.9264.70157615.50.28水胺硫磷2.919.85224022.00.20杀扑磷9.0711.66207611.50.22甲基对硫磷