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血细胞计数板显微镜直接计算法血球计数板的构造和使用方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，即1mm×1mm×0.1mm，其容积为0.1mm3；血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物数量的仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。血球计数板的结构大方格中方格小方格计数16×25型：一般取四角的四个中方格（100个小方格）计数25×16型：一般计数四个角和中央的五个中方格（80个小方格）的细胞数。计数室两种规格1．16×25型的计数板将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数。细胞个数／1mL＝100个小方格细胞总数/100×400×10000×稀释倍数2．25×16型的计数板中央大方格以双线等分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格，供细胞计数用（见图三）。一般计数四个角和中央的五个中方格（80个小方格）的细胞数。细胞个数／1mL＝80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数血球计数板的使用方法步骤1．镜检计数室。在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数；2．加样品。将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的酵母菌悬液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，一次性充满计数室，防止产生气泡，多余培养液可用滤纸吸去；3．计数。稍待片刻（约5min），待酵母菌细胞全部沉降到计数室底部后，将计数板放在载物台的中央，先在低倍镜下找到计数室所在位置后，再转换高倍镜观察、计数并记录。注意事项1.从试管中吸出培养液进行计数之前，建议将试管震荡几次，目的是什么？目的：使培养液中酵母菌分布均匀，以保证估算准确，减少误差2．如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当对培养液进行稀释。具体方法是：摇匀试管，取1mL酵母菌培养液，加入成倍的无菌水稀释，稀释n倍后，再用血球计数板计数，所得数值乘以稀释倍数。以每小方格内含有4—5个酵母细胞为宜。3．活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数，若芽体小于母细胞一半时为1个酵母细胞。4．对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相邻两边上的菌体数，一般可采取“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则处理，另两边不计数。5．计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算，对每个样品可计数三次，再取其平均值。6．血球计数板的清洁血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。例1、通常用血球计数板对培养液中酵母菌进行计数，若计数室为1mm×1mm×0.1mm方格，由400个小方格组成，如果一个小方格内酵母菌过多，难以计数，应先后再计数。若多次重复计数后，算得每个小方格中平均有5个酵母菌，则10mL该培养液中酵母菌总数有个。（参考答案：稀释；2×108）5×400×10000×10＝2×108。例2.检测员将1mL水样稀释10倍后，用抽样检测的方法检测每毫升蓝藻的数量；将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取少许培养液使其自行渗入计数室，并用滤纸吸去多余液体。已知每个计数室由25×16＝400个小格组成，容纳液体的总体积为0．1mm3。现观察到图中该计数室所示a、b、c、d、e5个中格80个小格内共有蓝藻n个，则上述水样中约有蓝藻个／mL。5n×105解析：从例题来看，是按照血球计数板的原理进行设计试题的，还添加了相应的图示，题意一目了然。按照前面所述的公式，不难得出正确答案：酵母细胞个数／1mL＝80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数＝n/80×400×10000×10＝5n×105。例3、（2008江苏高考31．）（4）在整个实验过程中，直接从静置的培养瓶中取培养原液计数的做法是错误的，正确的方法是和。（5）实验结束后，用试管刷蘸洗涤剂擦洗血球计数板的做法是错误的，正确的方法是。（参考答案（4）摇匀培养液后再取样样液稀释后再计数（5）浸泡和冲洗）