分析方法在中药药代动力学研究中的应用

LOGO分析方法在中药药代动力学研究中的应用药物分析任恒鑫中医中药历史悠久现代医学如何解开中药体内过程的奥秘？中药药代动力学中药药代动力学研究血药浓度法中药药代动力学生物效应法药理效应法药物累积法微生物指标法血药浓度法：该研究方法与化学药物的药代动力学研究原理、方法相似。是以一种或几种药理作用明确，结构已知的有效成分为指标，测定该成分在血液或其他生物组织中的浓度随时间变化过程，求出药代动力学参数，拟合药一时曲线，确定药代动力学模型，以此来反映中药及复方的药代动力学特征。血药浓度与中药药代动力学参数测定中的应用示例离子对反相高效液相色谱法测定兔血浆中氧化苦参碱含量氧化苦参碱(oxymatrine)是从豆科植物苦参(Sophora.flavescensAit．)、苦豆子(S.alopecuroideL.）及广豆根(S.subprostrataChunetT．Chen)中提取分离而得到的一种生物碱，是这几种常用中草药的主要有效成分。作者首次采用离子对反相高效液相色谱法，以非那西丁为内标物测定了血浆中氧化苦参碱的浓度，并对氧化苦参碱在家兔体内的药代动力学进行了研究。1．方法与结果(1)色谱条件：色谱柱:DiamonsilTMC18柱(200mmX4.6mmI.D.，5μm)流动相：乙腈-水(20:80，V/V，含庚烷磺酸钠5mmol／L，磷酸调Ph3.2)。柱温：40℃。流速：1.0ml／min。检测：紫外检测器，220nm波长处。灵敏度：0.01AUFS。进样量：1μl。(2)血浆样品处理：精密吸取血浆0.4ml，置于5ml具塞离心管中，依次加入重蒸馏水0.2ml，内标溶液100μl，6％HClO40.4ml，旋涡混合30s，离心(10000r/min)5min，上清液转移至10ml离心管中，加5mol/LNaOH溶液0.4ml，氯仿-正丁醇(98:2，v/v)提取溶液4ml，旋涡混合lmin，离心(4000r/min)10min。吸取下层有机相，40℃水浴氮气吹干，残渣用200μl流动相溶解，旋涡混合30s，离心(15000r/min)5min。取上清液1μl进样，记录色谱图。(3)专属性：在实验条件下，血浆中杂质不干扰样品及内标物的测定，氧化苦参碱及内标物的保留时间分别为6.5min和20.2min，二者能够完全分离.(4)标准曲线与线性范围：以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程为:y=0.01358+0.18728X，r=0.9965。线性范围为:0.5～100mg／L。(5)准确度与精密度：准确度与精密度数据如下:RE为-4.1％~4.0％；日内RSD6.7%,日间RSD13.9％。(6)氧化苦参碱与内标非那西丁的萃取回收率：氧化苦参碱的萃取回收率为89.4％~92.2％，RSD3.8％；内标非那西丁的萃取回收率为90.7％，RSD5.3％(7)血药浓度测定：健康家兔8只(雌雄兼用，体重2.0～2.5kg)，静脉注射氧化苦参碱40mg／kg，给药后0、5、10、15、30、45、60、00、120、150、180、240min定时静脉取血1.0ml。分离血浆．，取0.4ml血浆按“血浆样品处理”项下操作，测定氧化苦参碱浓度，并绘制平均药-时曲线，实验数据采用3P87药代动力学程序进行曲线拟合，据AIC最小准则，以及测定值与估算值之间的相关性，选择二室模型为其拟合模型，权重因子为1/C2t1/2=(9.45±4.84)mint1/2β=(143.60±171.80)minAUC=(1408.98±377.36)μg·min／mlCl=(0.034±0.015)／(kg·min)。2．讨论氧化苦参碱为一弱碱，其pH值约为7.8。氧化苦参碱极性很大，在一般流动相中很快出峰，溶剂峰对其测定有干扰，因此作者采用乙腈-水(20:80，V/V，含庚烷磺酸钠5mmol/L，磷酸调pH3.2)作为流动相。加入庚烷磺酸钠后，氧化苦参碱在6.5min出峰，适用于体内分析，与内源性物质能很好地分离。该色谱条件未见文献报道。中药体内分布与排泄研究中的应用示例生物样品中大黄蒽醌衍生物的RP-HPLC测定方法研究大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根和根茎，其主要有效成分为蒽醌类衍生物，以部分游离、大部分与葡萄糖醛酸结合成苷的形式存在。约占大黄成分的3％～5％。本文拟采用RP-HPLC法对口服大黄单、复方制剂后的生物样品(血浆及组织匀浆)经处理后，一次进样以测定大黄蒽醌衍生物(rhubarbanthraquino—nes)的含量，所建立的方法用于口服大黄单、复方制剂后蒽醌衍生物在家兔及大鼠体内的药代动力学和组织分布研究。1．方法与结果(1)色谱条件：色谱柱:HypersilC18柱(4.6mm×250mm，10μm)流动相:甲醇-乙腈-水(10:5:40，V/V，用磷酸调pH2.8)流速：1.0ml/min检测：紫外检测器，225nm波长处(2)对照品溶液与内标溶液的配制1)对照品溶液：取芦荟大黄素(aloe-emodin)、大黄酸(rhein)、大黄素(emodin)和大黄酚(chrysophanol)对照品各约10mg，精密称定，分别置l00ml量瓶中，用适量甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液于4℃冰箱避光保存。临用时，分别吸取各储备液适量置于同一量瓶中，，用甲醇稀释至所需浓度，即得蒽醌衍生物混合对照品溶液。2)内标溶液：取1，8-二羟基蒽醌约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标储备液于4℃冰箱内保存。临用时，用甲醇稀释至20μg／mll，即为内标溶液。(3)血浆及组织匀浆样品预处理方法：于10ml具塞试管中加入血浆(0.4~1.0m1)或组织样品适量(采集的全量样品)，加入内标溶液100μl旋涡混合30s，加入15％硫酸0.5ml，涡旋混合30s，水浴加热(70℃±2℃)水解30min。冷却，加入乙醚4.0m1，涡旋混合提取5min，3000r/min离心5min，吸取乙醚层(组织样品的乙醚层再加入水约3.0ml涡旋混合萃取5min，3000r/min离心5min，吸取乙醚层，如此反复用水洗涤乙醚层至水层无色)。通压缩空气吹干，残渣用甲醇100μl溶解，3000r/min离心5min，吸取上清液40μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按内标法计算各个蒽醌衍生物的含量。(4)线性关系与检测限：以蒽醌衍生物对照品／内标峰面积比值y对浓度C(mg／L或mg／kg)进行线性回归。结果表明，蒽醌衍生物生物样品浓度在考察范围内线性关系良好；以信噪比(S／N)3计。(5)回收率：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚相对回收率为94.6％～102.4％，RSD为1.8％～5.5％，n=5；萃取回收率为69.65％～76.69％(芦荟大黄素74.91％，75.70％，75.08％；大黄酸75.58％，76.50％，76.69％；大黄素73.22％，75.76％，76.43％；大黄酚70.05％，69.65％，72.45％；内标69.78％，70.56％，70.85％)。(6)精密度：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚日内RSD均为0.57％～4.7％(n=5)；日间RSD均为0.55％～8.2％(n=5)。(7)大黄药材提取液与复方WPY颗粒在大鼠体内组织分布研究：6只大鼠分别于灌胃后1，2，4，6，12h自股动脉取血，分取出心、肝及肾组织，用枸橼酸盐缓冲液(pH6.2)冲洗干净，滤纸吸干水分，称定重量。分别加枸橼酸缓冲液2.0ml磨成匀浆，按照确定的方法进行处理和测定，测定结果表明含大黄的单、复方制剂中蒽醌类衍生物在大鼠体内的分布以肾脏半分布最高，血浆、心脏、肝脏中的分布依次降低。2.讨论(1)大黄蒽醌类衍生物与葡萄糖醛酸结合成苷时为水溶性物质，而其蒽醌母核结构为脂溶性化合物，我们在建立HPLC法进行测定时，主要是对蒽醌苷元进行测定，因而应将水，溶性的苷水解成脂溶性的蒽醌衍生物。将苷水解为苷元的方法有酸水解、碱水解和酶水解等多种方法，从易操作性和实验费用角度综合考虑，我们决定从酸水解的角度来进行生物样品的预处理方法的考察，在综合考察水解方法、萃取溶剂种类、水解的温度、水解用酸的种类、酸的浓度的基础上，决定选用15％的硫酸水浴(70℃±2℃)30min水解待处理的生物样品，使其中的苷水解为苷元便于测定。(2)由大黄蒽醌衍生物结构可知，为具强紫外吸收的脂溶性、弱酸性物质，在进行色谱条件筛选时，选用可限制各组分离解的离子抑制色谱法使各个组分均处于分子状态，从而使各个色谱峰之间达到基线分离且峰形对称。各成分的保留时间分别为：芦荟大黄素：7.11min；大黄酸：8.06min；大黄素：14.46mira内标：15.97min；大黄酚：20.16min。(3)由于组织匀浆中含有大量的内源性物质，不能采用与血浆样品相同的预处理方法对组织样品进行处理。鉴于内源性物质大多具水溶性，我们在综合考察固相萃取及液一液萃取方法的基础上，选用乙醚萃取出待测物质，再用水洗涤萃取物中的大量内源性物质，从而消除内源性物质对蒽醌类衍生物测定的干扰中药代谢物研究中的应用示例液相色谱-质谱联用法(LC／MS)示例液相色谱-串联质谱法鉴定大鼠血浆中的东莨菪碱及其代谢物东莨菪碱(scopolamine)是从茄科植物颠茄(AtropabelladonnaL.)、曼陀罗(DaturaStramoniumL.)及莨菪(HyosyamusnigerL.)等分离提取的一种托品烷类生物碱。为全面阐明该药在大鼠体内的代谢过程，本实验利用LC-MSn技术，对服药后的大鼠血样进行了定性分析，鉴定出了原药及其7种代谢物。1．实验部分(1)色谱条件：ZorbaxExtendC18不锈钢色谱柱(3.0mm×100mm，3.5μm)同种填料的色谱保护柱(2.1mm×12.5mm，5μm)。流动相：甲醇-2mmol／L醋酸铵水溶液(以甲酸调节pH3.5)(70:30，V／V)。流速：0.2ml／min。柱温：40℃。进样量：20μl。(2)生物样品的制备：6只健康Wister大鼠250g±10g。大鼠禁食12h，按50mg／kg灌胃给药东莨菪碱后，分别于15min、45min、2h、18h和24h眼眶取血，肝素抗凝，以5000r／min离心10min，上清液置于-70℃冰箱中保存备用。取各时间点的血浆，加3倍量甲醇沉淀蛋白，离心，上清液过0.45μm微孔滤膜，滤液用于LC-MSn分析。(3)质谱条件：ESI离子源，扫描范围：100～1000m／z。离子源喷射电压：4.5kV。毛细管电压：21V。毛细管温度：175℃。鞘气(N2)流速：40个单位。自动进样器直接进样，正、负离子方式检测。采用全扫描一级质谱(Fullscan)及其源内碰撞诱导解离(S-CID)、全扫描二级质谱(FullscanMS2)及三级质谱(FullscanMS3)等方式进行测定。仪器自动优化的二级及三级相对碰撞能量均为30％。2．结果与讨论(1)大鼠血浆中母体药物及其主要代谢物的鉴定：在大鼠血浆样品中发现了东莨菪碱及其代谢物，其LC-MS色谱及其对应的二级质谱分别见图9-12和图9-13分子离子m／z304(M0)的保留时间(2.91min)及其二级质谱(图9-13-F)和东莨菪碱相同，所以，M0即为未被代谢的原药；分子离子m/z156(M1的二级质谱和原药的三级质谱m/z304-156相同，且出现原药的碎片m/z138、110和98，所以，M1应该是东莨菪碱大鼠体内的水解产物，即莨菪品。分子离子m/z142(M2)及其二级碎片m/z124、114、96、84、70/分别比m/z156(M1)及其二级碎片m/z138、128、110、98、84少14Da，可以鉴定M2为M1的N-去甲基产物。m/z286(M4)的分子量比原药少18Da，而特征碎片m/z110和13