分析方法的验证

1分析方法的验证2内容：一、介绍二、分析方法验证三、常见问题3一、介绍方法分析：是为完成检验项目而设定和建立的测试方法，它详细描述每一个分析试验所必须的步骤。一般包括分析方法原理、仪器及仪器参数、试剂、供试品溶液与对照品溶液等的制备、测定、计算公式及限度要求等。一、介绍分析方法确认或验证相关指南机构或组织文件名称美国药典（USP）1225Validationofcompendialprocedures方法验证1226Verificationofcompendialprocedures方法确认人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）Q2（R1）ValidationofAnalyt8icalProceduresQ2（R1）分析方法验证《中国药典》2010年版一部附录“中药质量标准分析方法验证指导原则”二部附录“药品质量标准分析方法验证指导原则”。5二、分析方法验证1、方法验证的定义：是根据检测项目的要求，预先设置一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的实验来验证所采用的分析方法能否符合检测项目的要求。2、分析方法验证的目的：是判断采用的分析方法是科学、合理，是否能控制产品的内在质量，证明分析方法适合相应检测要求。二、分析方法验证3、分析方法验证范围1.采用新的检验方法；2.检验方法需变更的；3.采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方法；4.法规规定的其他需要验证的检验方法二、分析方法验证4、需验证的检验项目1）鉴别试验2）杂质的限度检查3）杂质的定量测定4）含量测定，包括原料药或制剂中有效成分的含量，制剂中其他成分（如防腐剂等）的含量，溶出度与释放度等检查中的溶出量，以及含量均匀度。化学药品/中药制剂中其他需控制成分(如残留物、添加剂等）的测定1）专属性2）线性3）范围4）准确性5）精密度6）检测限7）定量限8）耐用性9）系统适用性5、分析方法验证的具体内容根据检测的类型采用的技术检测方法确定具体方法拟订验证的内容二、分析方法验证1）专属性定义：是指在其他成份（如：杂质、降解产物、辅料等）可能存在的情况下，采用的方法能正确测定出被测物的特性；能反映该分析方法在有共存物时对供试物准确而不受干扰的测定能力。通常，鉴别试验、杂质检查、含量测定均应考察其专属性。一种分析方法不太可能对某一特定的被分析物具有专属性(完全辨别)，在此情况下，建议采用两种或两种以上的分析方法以达到所需的辨别水平。91）专属性含量测定目的是得到样品中被分析物的含量或效价的准确结果。对于色谱法和其他分离方法来说，应当用具有代表性的色谱图来证明专属性，并在图上适当地标出每一种成分。色谱法的分离度应符合要求。1）专属性已知杂质：对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的试样比较测定结果。未知杂质：可以通过测定含有杂质或降解产物的试样，与另一已验证的方法或药典方法比较结果。或进行破坏性试验证明，在相对激烈的条件下：光热、酸碱、氧化、还原等，比较破坏前后的结果的差异。112）线性线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量测定和含量定量测定均需验证线性。2）线性试验方法应在规定的测定范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列样品的方法进行测定，至少制备5个浓度的供试样品，每个浓度各一份，每份供试样品检测3次，以测得的响应信号最为被测被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。132）线性一般配制方法：在含量测定浓度的80%-120%均匀选择至少五个不同的浓度点配制溶液各三份。142）线性数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。推荐接受标准：相关系数R≥0.998其截距不应明显地偏离零点。153）范围范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。范围通常与分析方法的测试结果相同的单位表达。涉及到定量测定的检测项目均需对范围进行验证。3）范围含量测定时，范围通常为测试浓度的80%-120%。4）准确度定义：系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。一般用回收率(%)表示。一定的准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需对准确度进行验证。4）准确度测定回收率R一般采用空白回收法和加样回收法。空白回收：已知量为P的对照品。测定值为A。如在六个空白样品中，分别加入已知浓度的样品（浓度范围为含量测定浓度的80%-120%）194）准确度加样回收:在已准确测定含量为P的样品中+已知量为A的对照品或标准品测定，测定值为M。4）准确度方法准确度应在规定范围内建立，至少用9个测定结果进行评价。例如：测定含量的准确度，按标示量的80%，100%和120%配制三个浓度的溶液，每个浓度各配制3份供试品溶液，进行测定。214）准确度数据要求：需报告已知加入量的回收率（%），或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差。一般推荐含量（HPLC、GC、UV）的回收率（平均值）要求在98.0%-102.0%范围内。杂质的定量测定的回收率（平均值）：限度＜0.5%，在80%-120%范围内；0.5%≤限度＜5%，在90%-110%范围内；限度≥5%，在95%-105%范围内。225）精密度精密度系指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。5）精密度名称定义验证方法重复性在相同条件下，由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。在规定的线性范围内至少测定9次(例如3种浓度／每种浓度3次)，或在100％的实验浓度下，至少测定6次。中间精密度在同一个实验室，不同时间由不同分析人员,用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。应根据方法使用的环境而定，确定随机事件对分析方法精密度的影响。变动因素为：不同日期不同分析人员不同设备重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度通过实验室之间的检测来评价；如果方法需要标准化如收载到药典中的方法，则应考虑重现性。这些资料不是申请上市文档的三部分。协作标定能力验证药品标准的实验复核系统重复性：相同条件下，同一分析人员对同一样品溶液多次测试结果的接近程度。同一均匀标准样品溶液，连续重复测定六次，计算各组分响应值与平均值之间的相对标准偏差。方法重复性：相同条件下，同一分析人员对同一个均匀样品，多次取样测定所得结果的接近程度。同一样品，至少称取六份，再测定每一份样品含量，计算每一次测定的含量与平均含量间的相对标准偏差。255）精密度6）检测限（LOD或DL)检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量。常用方法如下：1.直观法用已知浓度被测物的样品，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。用于非仪器分析法(目视法)，也可用于仪器分析法。6）检测限（LOD或DL)2.信噪比法：仅适用于能显示基线噪音的分析方法。-即把已知低浓度试样的测试信号与空白样品的测试信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最小浓度。-通常信噪比为3：1或2：1时，检测限可以被接受。276）检测限（LOD或DL)数据要求应当提供检测限和测定检测限的方法如果方法采用信噪比法，应提供测试图谱，说明测试过程和检测限结果。7）定量限（LimitofQuantitative,LOQ或QL）定义：定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定定量限。推荐测定法：-以信噪比10:1时的浓度(或量)进样测定,重复测定的响应值应满足精密度要求。8）耐用性定义：耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。可用于说明正常使用时的可靠性。1.典型的变动因素有：被测溶液的稳定性,样品提取次数，时间等。8）耐用性--考察因素2.HPLC法中典型的变动因素：流动相pH值变化的影响；流动相组分变化的影响；不同色谱柱(不同的批号和／或供应商)；柱温；流速。8）耐用性--考察因素3.GC法中典型的影响因素：不同色谱柱(不同的批号和／或供应商)；柱温流速固定相不同类型的载体8）耐用性--考察因素4溶液的稳定性研究溶液的稳定性研究用来证明根据相应方法制备的样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在一定时间内保持稳定。如果方法中没有规定有效期，样品溶液和标准品溶液需进行稳定性研究。测定结果与初始结果进行比较，符合接受标准便可确认样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在规定储存时间是稳定的。33二、分析方法验证6、验证接受标准（含量-HPLC,GC,UV）验证内容接受标准精密度/重复性RSD≤2.0%，n≥6中间精密度RSD≤2.0%，n≥4专属性色谱法：色谱峰分离，无干扰线性--相关系数--截距--剩余标准差r≥0.998≤2.0%≤2.0%范围至少标示量（100%溶液）的80-120%准确度--平均回收率--回收率的RSD98.0-102.0%(n=9，3个浓度，每个浓度三份样品）≤2.0%(n≥9，至少3个浓度，每个浓度测3次)稳定性-样品溶液-对照溶液规定时间内变化≤2.0%耐用性系统适用性实验通过需验证项目注意：“否”表示通常不需要做的项目：“是”表示通常需要做的项目。①假如已做了重现性，就不需再做中间精密度；②分析方法缺乏专属性，可以由其他分析方法来补充；③视具体情况予以验证，有些情况下可能需要。项目内容鉴别杂质测定含量测定定量限度准确度否是否是精密度重复性否是否是中间精密度否是①否是①专属性②是是是是检测限否是③是否定量限否是否否线性否是否是范围否是否是耐用性是是是是三、分析方法验证常见问题样品的选择问题供试品溶液制备考察不全面对照品溶液浓度与供试品不匹配标准曲线的制备样品测定不在线性范围之内取样、范围太小、单位等问题色谱条件的选择应详述理由并附相关图谱方法改变后应与原方法作比较对照品溶液的制备对照品称量难以达到精密称定的要求回收率测定问题37谢谢！