分析方法验证――2015.04.30

1分析方法验证刘进2015.04.27药品的生产过程中，原料、中间品、成品均需进行检验，检验结果既是过程受控的依据，也是评价产品质量的重要依据，检验结果应具有准确可靠。而分析方法的验证为检验结果的准确及可靠提供了有力保障。分析方法验证系指确保某项分析方法得出的结果可以持续地准确反映所测产品特性的书面证明。通常分析方法的验证可分为药典或注册分析方法的确认和非药典或注册分析方法的验证。2主要内容法规要求验证要求验证内容方法确认方法再验证参考资料3法规要求中国GMP(2010)、中国药典非常关注验证的过程,分析方法验证不完善是常见的问题。–药品质量标准中分析方法必须验证–药物生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法必须进行验证。4法规要求•EUGMPVolume4–Analyticalmethodshallbevalidated,alltestingoperationsdescribedinthemarketingauthorisationshouldbecarriedoutaccordingtotheapprovedmethod.5法规要求•FDAcGMP[21CFR211.]–Testmethod,whichareusedforassessingcomplianceofpharmaceuticalarticleswithestablishedspecifications,mustmeetproperstandardsofaccuracyandreliability.6法规要求第十二条质量控制的基本要求：（四）检验方法应当经过验证或确认；7法规要求第二百二十三条物料和不同生产阶段产品的检验应当至少符合以下要求：（二）符合下列情形之一的，应当对检验方法进行验证：1.采用新的检验方法；2.检验方法需变更的；3.采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方法；4.法规规定的其他需要验证的检验方法。8法规要求（三）对不需要进行验证的检验方法，企业应当对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠；9法规要求2010版药典中分析方法验证指导原则(附录XIXA)只规定了项目和基本方法而没有合格标准,ICH和USP类似10法规要求ICHQ2(R1)：ValidationofanalyticalProcedures:TextandMethodology--2005/11ICHQ2A：TextonValidationofAnalyticalProcedure(ParentGuideline)--1994/10ICHQ2B:ValidationofAnalyticalProcedures:Methodology(DevelopedtocomplementtheParentguideline)--1996/1111法规要求USP1225ValidationofCompendialProcedures•EuropeanDirectoratefortheQualityofMedicines&HealthCare[PA/PH/OMCL(05)47DEF]ValidationofAnalyticalProcedures–2005/061213法规要求药典或官方标准收载的方法－不需完整验证－需验证方法的适用性（确认）自研方法或对官方标准进行了大幅调整－需完整验证14问题一新版GMP中规定哪些情况下必须做方法验证？验证要求目的：证明采用的方法适合于相应的检测要求。15验证要求前提条件：①仪器：仪器已经过验证和校正且在有效期内；②人员：人员应经过充分培训，熟悉方法及所使用的仪器；③物料：所用的物料，包括标准品、试剂、实验用容器等，均应符合试验要求，不能带入污染、误差。如进行高效液相色谱分析时，所用试剂应为色谱级16验证要求前提条件：④方法：该分析方法的开发和优化已经成功完成；⑤环境：试验环境符合该分析方法的要求，例如：有些分析方法可能对温湿度敏感。17验证要求原则：原则上每个检测项目采用的分析方法，均需要进行方法验证。方法验证的内容应根据检测项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。。18验证要求原则：同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。例如，采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量试验应进行不同要求的方法验证，前者重点要求验证专属性，而后者重点要求验证专属性、准确度、定量限等验证项目。19验证要求主要方面：（一）需要验证的检测项目检测项目是为控制药品质量，保证安全有效而设定的测试项目。根据检测项目的设定目的和验证内容的不同要求，通常将需验证的检测项目分为鉴别、杂质检查（限度试验、定量试验）、定量测定（含量测定、溶出度、释放度等）、其他特定检测项目等四类。20验证要求主要方面：（二）分析方法分析方法是为完成上述各检测项目而设定和建立的测试方法，一般包括分析方法原理、仪器及仪器参数、试剂、系统适用性试验、供试品溶液制备、对照品溶液制备、测定、计算及测试结果的报告等。21验证要求主要方面：（三）验证内容验证内容通常包括方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限和耐用性。22问题2通常需要验证的项目有哪些？2324验证内容注：—表示通常不需论证的项目；+表示通常需论证的项目；①假如已论证重现性，可不需再论证中间精密度；②缺乏专属性的分析方法，应由其他分析方法来作补充；③有些情况不需要。25验证内容-系统适用性系统适用性试验是许多分析方法的组成部分，这些试验的基本概念是要把由分析设备、电子仪器、实验操作和被分析样品所组成的完整系统进行整体评估。对于特定方法的系统适用性参数的建立依赖于被验证方法的类型。Ø常见的考察参数有：理论塔板数、分离度、容量因子、拖尾因子、峰纯度等。Ø除药典另有规定外，液相色谱的内部标准为：N≥2000，R≥1.5，T≤1.5；气相色谱的内部标准为：N≥5000，R≥1.5。26验证内容-系统适用性27验证内容-专属性指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。通常，鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应考察其专属性。如采用的方法不够专属，应采用多个方法予以补充。28验证内容-专属性1、鉴别反应鉴别试验应确证被分析物符合其特征。专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，需确证含被分析物的供试品呈正反应，而不含被测成分的阴性对照呈负反应，结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应。29验证内容-专属性2、杂质检查作为纯度检查，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、有机溶剂等。因此杂质检查要求分析方法有一定的专属性。在杂质可获得的情况下，可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质与共存物质能得到分离和检出，并具适当的准确度与精密度。验证内容-专属性2、杂质检查在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过与另一种已证明合理但分离或检测原理不同、或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确定。或将供试品用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化的方法进行破坏（制剂应考虑辅料的影响），比较破坏前后检出的杂质个数和量。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行色谱峰纯度检查。30验证内容-专属性3、含量测定含量测定目的是得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果。在杂质可获得的情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的供试品比较测定结果。在杂质或降解产物不能获得的情况下，可采用另一个经验证了的或药典方法进行比较，对比两种方法测定的结果。也可采用破坏性试验（强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化），得到含有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含量测定，比较测定结果。必要时进行色谱峰纯度检查，证明含量测定成份的色谱峰中不包含其他成份。3132验证内容-专属性可接受标准1.应当证明潜在的干扰成分不会对方法的性能产生负作用。对于层析分离方法，要求证实杂质之间﹑杂质与主峰之间的选择性；分辨率≥1.5，如果证明确实可行，某些情况下分辨率低于1.2也可以接受。2.空白对照应无干扰。33验证内容-专属性34验证内容-准确度准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率%表示。准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证其准确度，如杂质定量检查、含量和溶出方法，分析方法的准确度能够确保：①样品中的待测物全部溶解；②待测物全部从检测器中检出。35验证内容-准确度准确度的测定至少选取包括标准浓度在内的至少3个浓度级别（通常选取80％、100％和120％），每个浓度级别至少测定3次，计算测定结果的回收率。36验证内容-准确度原料药1.可用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定；2.用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。37验证内容-准确度制剂1.用含已知量被测物的各组分混合物进行测定；2.如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定（加样回收试验法）；3.用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。38验证内容-准确度杂质1.往样品中加入已知量的杂质进行测定；2.若不可能得到某种杂质或降解产物，可把此方法的分析结果与另一已验证的或药典的分析方法获得的结果进行比较。39验证内容-准确度通常采用回收率测定的试验可分为：空白回收（制剂空白）加样回收（适用于：中药材，复方制剂等）空白回收的计算方法：40验证内容-准确度加样回收的计算方法：其中：M为测定值；P为背景值；A为已知值（真实值）。41验证内容-准确度加样回收的试验方法：同一样品，制备三个浓度的供试品，每个浓度分别制备三份供试液，例如：取相同量样品9份（一般为样品取样量的一半），设计三个浓度，按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1:1比例加入；低浓度和高浓度可分别选0.5:1和1.5:1的比例，加入对照品的量要适当，保证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。42验证内容-准确度接受标准含量和溶出：HPLC方法的接受标准各浓度下的平均回收率应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。中药一般应满足以下规定：回收率计算值在95%-105%范围，相对标准偏差（RSD%）薄层扫描法5%。43验证内容-准确度接受标准含量和溶出：UV方法的接受标准各浓度下的平均回收率应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于1.0%。容量分析方法的接受标准各浓度下的平均回收率应在99.7%-100.3%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于0.2%。44验证内容-准确度接受标准杂质：45验证内容-准确度注意问题1.活性物质；2.容器或过滤器可能会吸附活性物质；3.处方中的辅料、色料和制造过程可能会影响准确度。4.待分析物质是否完全溶解以及溶液的澄清度。46验证内容-准确度47问题三什么是准确度？准确度用什么来表示？48验证内容-精密度精密度系指在规定的条件下，从同一个均匀样品中，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差（d）、标准偏差（SD）、相对标准偏差（RSD）（变异系数CV）表示。偏差（d）d=xi-x测量值与平均值之差；标准偏差（SD）相对标准偏差（RSD）49验证内容-精密度50验证内容-精密度杂质定量检查、含量和溶出方法均应验证其精密度，精密度可以用重复性、中间精密度和重现性表示。1、重复性重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所