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临床微生物实验室血培养操作规范刘英2015-6-11血液及无菌体液——最有意义的病原学检测标本根据培养结果：选择正确的抗感染治疗方案调整经验治疗方案判断感染性疾病的类型评价疗效及预后正确采取感染控制措施是否隔离减少院内感染监测敏感事件（如：生物恐怖）完整的血培养过程医师开出医嘱护理人员收集送检样本实验室检测、分离并鉴定导致血流感染的微生物三级报告：为临床医生提供抗菌药物敏感性试验结果我院：10年统计新生儿20%13-14年6-8%国内血培养现状—阳性检出率低10%（国外约为15％）原因何在？血流中含菌量低血液中抗菌物质抗生素的应用培养条件限制血培养的临床实践欠规范！！一、采血指征可疑感染患者出现以下一种或几种特征时，可以考虑采集血培养：a)发热（≥38℃）或低温（≤36℃）；b)寒战；c)白细胞计数增多（计数10.0×109/L，特别有“核左移”时）或减少（计数3.0×109/L）；d)皮肤黏膜出血；e)昏迷；f)多器官衰竭；g)血压降低；h)C反应蛋白升高；i)降钙素原（PCT）升高；j)1,3-β-D-葡聚糖（G试验）升高；k)突然发生的急性呼吸、体温和生命体征改变。采血时间宜在寒战或高热高峰前后采集，用抗菌药物之前采集。03060时间(分钟)体温血培养采血时机细菌浓度血培养套数应同时采集2～3套血培养，2d～5d内无需重复采集血培养。只有在怀疑感染性心内膜炎或其它血管内感染（如导管相关性感染）时，才有必要间隔多次采集血培养。对于新生儿，采集一瓶儿童需氧瓶，宜同时做尿液和脑脊液培养。采血量成人每瓶采血量8mL～10mL，儿童1mL～5mL，但不应超过患儿总血量的1%。血液和肉汤之比为1：5～1：10。新生儿0.5mL。采血量充足的患者宜配套采集需氧瓶和厌氧瓶，将血液先注入厌氧瓶，后注入需氧瓶。采血量不足的患者应将足量血标本先注入需氧瓶，再将剩余血液注入厌氧瓶。有利于分离出真菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌。血培养瓶运送血培养瓶应尽快送至实验室孵育或上机，如果运送延迟，应在血液接种以后尽快35℃～37℃孵育，切勿冷藏或冷冻。如果病房没有孵箱，血培养瓶应置于室温下，而非冷藏或冷冻。7血培养安全防护7.1实验室获得感染途径针刺伤病毒感染，包括乙肝病毒、丙肝病毒和HIV；皮肤粘膜暴露是肝炎病毒和逆转录病毒感染的主要途径，而其它的主要途径是气溶胶或微滴。7.2防护措施7.2.1洗手洗手是预防实验室获得感染的关键要素。在戴手套前、摘手套后、工作结束后、离开实验室和进入清洁区时，都必须洗手。如直接接触血液或任何潜在的感染性物质后必须立即清洗暴露部位。7.2.2防护屏障1.采集血培养时应戴手套，采集下一患者时须换手套。血液污染手套、有破损迹象或失去防护作用时，必须及时更换。在接收和处理标本时，需要戴手套。2.可能发生血液或其它感染性物质喷溅的情况下，需要面部防护。3.在没有安全柜的情况下，血培养操作和检验时需要穿防水、长袖、前面封闭的隔离服。存在任何可见污染时立即脱去。污染的隔离服必须作为生物危险垃圾丢弃或严格按流程清洗。离开实验室或去实验室内的清洁区时要脱去隔离服。4.在处理阳性血培养瓶时，必须在Ⅱ级生物安全柜中进行。7.2.5标准防范措施所有实验室员工应接受基本原理及标准防护措施的操作培训。相关的安全防护措施包括以下内容：a)尽可能减少注射器及锐器的使用；b)必须使用注射器时，应避免回套针帽；c)若用注射器采集血液，将血液直接注入血培养瓶，无需更换针头。注射器使用完毕后，应将针头放入锐器桶，不可重复使用；d)使用后的注射器或其他锐器如需转运，必须装入锐器桶内。7.2.6实验室意外事故控制在污染区域采取能使实验室人员暴露风险最小化的控制程序。禁止在污染区用嘴吹吸移液管、咬指甲、抽烟、饮食、摘戴隐形眼镜、手或其他环境表面与眼、鼻、嘴接触等。可能发生溢洒喷溅的操作，必须在生物安全柜中进行。离心机宜使用带有生物安全罩的转子或离心桶。尽可能采用螺口密封的塑料离心管，使用前仔细检查塑料离心管有无损坏的迹象。因样本中可能含有经空气传播的病原体，转子或离心桶及离心的样本应在生物安全柜中打开。在打开转子或离心桶前，检查内部离心管有无损坏。7.3.3标本处理所有标本必须在生物安全II级防护下处理。疑为高致病性病原体如结核分枝杆菌、布鲁菌属、弗朗西斯菌属、鼠疫耶尔森菌、类鼻疽博克霍尔德菌阳性的血培养瓶进行传代培养时，处理操作需按生物安全III级防护进行。疑为脑膜炎奈瑟菌的菌株必须在生物安全柜中处理。8血培养结果的处理及报告程序8.1血培养阳性处理及三级报告程序一级报告（初步报告）对于阳性血培养，要立即进行涂片和革兰染色，并报告给临床医师，包括：患者姓名、阳性血培养瓶类型、瓶数、报警时间、涂片革兰染色特性及形态，询问患者目前感染情况和抗菌药物使用情况并记录，可以向医师提出治疗建议。此外，还应记录报告时间、接收报告者信息和报告者信息。同时将阳性培养液传种适当培养基。各单位可以根据自身医疗需求，决定是否基于涂片结果用培养液进行直接药敏试验。二级报告（补充报告）第二天将初步鉴定结果回报医师。如进行直接药敏试验，应回报药敏结果。三级报告（终报告）包括菌种名称、血培养阳性时间（以小时计算）和标准药敏试验结果。报告内容：血培养经XX天培养阴性，自动化仪器细菌培养一般设定周期为5d、真菌14d、分枝杆菌42d；手工法细菌培养一般周期设定为7d、真菌14d、分枝杆菌60d。可以在72h培养阴性后，进行初步报告，但应说明“培养3d阴性，标本将延长培养至XX天，如为阴性不重复报告”。如果72h后阳性，应按血培养阳性报告程序处理，与临床沟通并补发阳性报告。8.2血培养阴性报告程序血培养质量控制9.1检验前质控患者评估血培养申请标本采集实验室应定期对血培养污染率进行评估，污染瓶数应控制在5%以下。如超过此标准，则应与临床进行沟通，并采取相应控制改进措施。标本转运标本接收和处理以下情况的血培养标本，可以接收但是需要告知医师：a)采血量不足；b)血培养套数或瓶数不够；c)仅接种需氧或厌氧瓶。9.2检测中质控培养系统的性能验证，自制培养瓶的室内质控，革兰染色、鉴定试剂、仪器、培养基质控和药敏试验质控，结果审核和报告解释。实验室应对每个项目的质量控制，制订详细的标准作业程序（SOP）。9.3检测后质控实验室应对阳性血培养涂片口头报告。应建立初步药敏报告和最终报告的审核制度，并进行定期汇总分析，对实验室信息系统（LIS）需进行传输和性能验证。实验室应对以上项目制订SOP。14血培养污染即便进行严格的皮肤消毒以及在接种、传代中严格遵守无菌操作，仍有3%～5%的血培养结果来自皮肤（如表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、梭菌、类白喉棒状杆菌）或周围环境（如不动杆菌属、芽胞杆菌属）的污染菌株。然而，这些微生物有时也会成为致病菌甚至可导致心内膜炎。在下列情况可能是致病菌：a)不同部位血液标本的培养瓶中培养出同一种微生物；b)生长迅速、48h内；c)多次分离出具有同样生物学特性和相同药敏结果的菌株。所有的结果都应向临床医生报告，包括可能的污染菌，但不做药敏试验，在报告单上应有恰当的提示，如痤疮丙酸杆菌（皮肤共生菌）。血培养发现两种或两种以上细菌生长，可能是复数菌菌血症，常见于衰弱的患者，也可能是污染所致。发生厌氧菌菌血症时可能有多种病原菌感染，如肠道的严重创伤或手术，可发生严重的暴发性菌血症，此时可有一种或多种厌氧菌与一种或多种需氧菌在血中同时存在。2.4血培养污染率一般由凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌、芽孢杆菌、痤疮丙酸杆菌和微球菌等污染引起的阳性瓶占总送检瓶数的比例。血培养的污染分析理想的消毒条件下，仍有3%5%污染菌不可能5%不能确定30%可能70%金葡菌肺炎链球菌肠杆菌科菌绿脓杆菌白色念珠菌•棒状杆菌.•非炭疽革兰阳性杆菌•痤疮丙酸杆菌凝固酶阴性葡萄球菌Source:KimSD,etal:InfectControlHospEpidemiol2000;21:213-7预测其可能性病人危险因子prosthetic装置临床证据试验后的分析#阳性/#培养物比较抗菌谱比较基因型血培养假阳性的原因分析（1）血液中的白细胞数过高：分析其原因可能是标本中全血白细胞过高可释放一定量的CO2使pH改变导致假阳性．可能与抽血量12ml，从而导致瓶内过多的白细胞富集；血培养假阳性的原因分析（2）温度不稳定引起假阳性，由于停电所致，说明停电是引起假阳性的原因之一也可能培养基从冰箱中取出立即抽血假阴性的原因分析（2）也可能与抽血后培养瓶放入仪器前置室温或普通孵箱中过久有关。苛养菌感染：包括链球菌和流感嗜血杆菌等，此类细菌在培养过程中，生长缓慢，代谢能力极低，导致培养瓶中各项指标变化都低于仪器的检测范围，引起仪器出现假阴性结果。血培养报阳后涂片阴性处理程序1、多数情况采用瑞氏染色可以看到细菌2、盲传固体培养基，并且延长培养时间