免疫荧光技术

免疫荧光技术一、一些基本概念和基本知识：1荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。2.技术分类：⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术)抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。⑵免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法3荧光的产生：物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质，称为荧光素由光激发所引起的荧光，为光致荧光------荧光免疫技术由化学反应所引起的荧光，为化学荧光------化学发光技术4荧光素的荧光特性：⑴停止供能，荧光现象随即终止⑵对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长发射光波长⑶荧光效率：发射荧光的光量子数荧光效率=吸收光的光量子数⑷荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱5常见荧光素：⑴FITC⑵RB200⑶TRITC⑷镧系：Eu、Tb⑸PE⑹其它常见荧光素的特性：⑴FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。⑵RB200：橘红色粉末,吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。⑶TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。⑷镧系：Eu、Tb⑸PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。⑹其它：酶作用后产生荧光物质。酶作用后产生荧光物质：酶底物产物激发光发射光Β-GMUGMU360450APMUPMU360450HRPHPA二聚体3174146合适荧光素的选择⑴具有与蛋白质形成共价键的化学基团。荧光素-N=C+NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质‖︱︱‖︱SHHSH⑵荧光效率高，标记后下降不明显。⑶荧光色泽与背景色泽对比鲜明。⑷标记后能保持生物学活性和免疫活性⑸标记方法简单、快速。⑹安全无毒二、荧光抗体的制备1荧光素与抗体结合（标记）2荧光抗体的纯化3荧光抗体的鉴定1荧光素与抗体结合方法：⑴透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体积小的抗体溶液的标记②标记较均匀，非特异荧光较低⑵搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品体积较大的抗体溶液的标记②标记时间短、效率较高，荧光素用量节省③影响因素多，非特异荧光较强透析法第一步：将含10mg/ml的Ig溶液10ml装入透析袋。第二步：将上述透析袋放入烧杯中：含0.1mg/mlFITC的pH=9.4的碳酸盐缓冲液100ml。第三步：4℃磁力搅拌24h。第四步：取出透析袋，进行纯化、鉴定。搅拌法第一步：将含40mg/mlBP溶液5ml装入反应瓶中。第二步：加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐缓冲液4ml第三步：25℃磁力搅拌下，逐滴加入1ml含2mg的FITC溶液第四步：25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌4h，然后进行纯化、鉴定。2荧光抗体的纯化：⑴除去未结合荧光素⑵除去标记不适当的抗体⑶除去非特异反应物质⑴除去未结合荧光素：A透析法：将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，在4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。B凝胶过滤法：葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml。⑵除去标记不适当的抗体：采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。⑶除去非特异反应物质：将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合，4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在用50mg/ml比例重复一次。3荧光抗体的鉴定：⑴抗体含量测定：双扩法⑵结合比率(F/P)测定：分光光度法，并按下式计算：FITC:F/P=2.87×A495/(A280-0.35×A495)RB和TRITC:F/P=A515/A280*F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。*固定标本染色以F/P=1.5左右为宜*活细胞染色以F/P=2.4左右为宜三、荧光抗体技术：㈠抗原片的制作㈡试验类型㈢荧光显微镜检查㈠抗原片的制作1制作：临床常见的标本有组织、细胞细菌三大类。可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗原片。2标本的固定：⑴固定目的防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。易于保存。（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用活细胞染色）。⑵常用的固定方法：抗原固定剂固定方法蛋白质95%乙醇室温3~10min或4℃30minIg类甲醇同上酶类丙酮同上激素CCl4同上类脂质10%福尔马林室温3~10min多糖(细菌)10%福尔马林室温3~10min或4℃30min丙酮、甲醇病毒无水乙醇室温5~10min或4℃30~60min丙酮、CCl4或-20℃60min以上㈡试验类型1直接法2间接法3补体结合法4双标记法抗原标记抗体光原荧光直接法原理示意图间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光补体抗体标记抗补体抗体光源荧光补体结合法原理示意图㈢荧光显微镜检查：（由实验课介绍）三、其它免疫荧光技术1流式细胞仪2时间分辨免疫荧光技术3荧光偏振免疫分析技术时间分辨荧光免疫测定(time-resolvedfluoresenceimmunoassay,TR-FIA)基本原理是：利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。时间分辨荧光测定的特点：1采用脉冲光源(每秒闪烁1000次以上的氙灯),照射样品后即暂短熄灭.2以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测镧系荧光。3镧元素具有较长的荧光寿命(105ns)，延缓测量时间，能有效地消除非特异本底荧光(10ns)的干扰，4镧系螯合物的激发光与荧光发射峰之间的波长差异(即较大的Stokes位移），有利于排除非特异性荧光干扰，提高检测特异性。镧系元素有Eu、SmTb、Nd和Dy等，其中以Eu最为常用。5测定技术类型有：竞争法、夹心法、间接法等。荧光偏振免疫分析技术（fluorescencepolarizationimmunoassay,FPIA）是利用荧光素经单一波长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小成正比的关系而建立的免疫分析技术；技术类型主要采用竞争法。四、荧光免疫技术的新发展：上转磷光技术的进展