酵母双杂交系统技术介绍

酵母双杂交系统技术介绍February3,2020宝日医生物技术（北京）有限公司•酵母双杂交系统技术介绍22/3/2020•主要内容•酵母双杂交的背景介绍•酵母双杂交的基本原理•Clontech酵母双杂交系统•常见问题分析•酵母双杂交系统技术介绍32/3/2020•背景介绍:关注蛋白质蛋白质相互作用研究蛋白组时代蛋白质功能生物信息学的发展•酵母双杂交系统技术介绍42/3/2020•背景介绍:为什么要研究蛋白互作？发现新的蛋白质和蛋白质的新功能在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用筛选药物的作用位点研究药物对蛋白质之间相互作用的影响建立基因组蛋白连锁图•酵母双杂交系统技术介绍52/3/2020•背景介绍:Clontech酵母双杂交系统的功能发现新的与已知蛋白互作的蛋白鉴定两个蛋白之间的相互作用确定蛋白相互作用的区域•酵母双杂交系统技术介绍62/3/2020•背景介绍:Clontech分子生物学工具ClontechMatchmaker™GeneFunctionGeneExpressionGenediscovery•酵母双杂交系统技术介绍72/3/2020•背景介绍:MatchmakerGold系统•Matchmaker™GoldYeastOne-HybridLibraryScreeningSystem（630491）酵母单杂交-蛋白与DNA的相互作用•Matchmaker™GoldYeastTwo-HybridSystem（630489）•Makeyourown“Mate&Plate™”librarySystem(630490)酵母双杂交-蛋白与蛋白的相互作用•pBridgeThree-HybridVector（630404）酵母三杂交—三个蛋白之间的相互作用•酵母双杂交系统技术介绍82/3/2020•背景介绍:MatchmakerGold系统原理ReporterGeneReporterGeneReporterGene•酵母双杂交系统技术介绍92/3/2020•主要内容•酵母双杂交的背景介绍•酵母双杂交的基本原理•Clontech酵母双杂交系统•常见问题分析•酵母双杂交系统技术介绍102/3/2020•基本原理:酵母双杂交参考文献•Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.•Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.•FieldsS,SongO.•DepartmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.63000次引用•酵母双杂交系统技术介绍112/3/2020•基本原理:GAL4转录因子的结构ADDNA-BDGAL4蛋白具有两个功能结构域BD结合结构域AD激活结构域•酵母双杂交系统技术介绍122/3/2020•基本原理:GAL4转录因子的分子机理在GAL4based双杂交系统中:正常情况在酵母细胞内:PromotergalmetabolicgeneGALUASTranscriptionReporterGeneGAL4AD•酵母双杂交系统技术介绍132/3/2020•基本原理:三个启动子，四个报告基因获得阳性克隆子报告基因表达AbA抗性筛选Ade营养筛选His营养筛选X-a-gal蓝白筛选M1G1G2•酵母双杂交系统技术介绍142/3/2020•主要内容•酵母双杂交的背景介绍•酵母双杂交的基本原理•Clontech酵母双杂交系统•常见问题分析•酵母双杂交系统技术介绍152/3/2020•ClontechMM系统的优点设计巧妙抗性筛选异常简便SMART方法与同源重组技术结合构建文库，聪明的酵母自己做克隆。AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景生长，大大降低假阳性。文库构建于型酵母菌株α型Y187中，方便后续与a型菌株Y2HGold进行mating直接筛选。•酵母双杂交系统技术介绍162/3/2020•ClontechMM系统:蛋白互作基本流程自己构建文库：630490预制细菌文库：638802（传统型）预制酵母菌文库：630480（均一化，通用型）Clontech蛋白互作相关试剂盒酵母双杂交系统：630489酵母菌转化试剂盒：630439酵母培养基（套装）：630495插入片段检测：630497酵母质粒提取：630467体内验证：630489630305体外Co-IP验证：630458630459631723631604•酵母双杂交系统技术介绍172/3/2020•文库构建:ClontechMM文库构建方法SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmatingAAAAAAAAACCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGG•酵母双杂交系统技术介绍182/3/2020•SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmating自己做克隆文库构建:ClontechMM文库构建方法•酵母双杂交系统技术介绍192/3/2020•SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmating文库构建:ClontechMM文库构建方法•酵母双杂交系统技术介绍202/3/2020•文库构建:ClontechMM自制文库筛选SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmatingDDO/X/A混合QDO/X/A•酵母双杂交系统技术介绍212/3/2020•文库筛选:ClontechMM文库筛选630489Matchmaker™GoldYeastTwo-HybridSystem630489Y187Y2HGold三个载体阳性对照，阴性对照。BDvector：pGBKT7ADvector:pGADT7630439极大提高转化率可以单独购买•酵母双杂交系统技术介绍222/3/2020•文库筛选:ClontechMM系统质粒诱饵载体InY2HGold文库载体InY187•酵母双杂交系统技术介绍232/3/2020•文库筛选:诱饵载体构建及其自激活检测SD-Trp/X/A•酵母双杂交系统技术介绍242/3/2020•文库筛选:Mating方法筛选Y187α型DDO筛选二倍体Y2HGolda型Mating接合反应酵母的有性生殖过程，Clontech利用这个过程，实现了文库筛选。MixMatingQDO筛选•酵母双杂交系统技术介绍252/3/2020•文库筛选:均一化通用文库筛选均一化通用型文库高丰度与低丰度均衡大大降低工作量大大降低假阳性更高的基因代表性NormalizedUniversalPre.libraryDDO/X/A混合QDO/X/A•酵母双杂交系统技术介绍262/3/2020•文库筛选:传统细菌文库筛选文库培养提取质粒转化酵母菌取1ml菌液按照一定比例用LB稀释，150ul/板进行涂板，过夜培养。将提取的质粒转化Y187，获得酵母文库。Mating筛选将文库与诱饵培养液混合，进行Mating。涂筛选板，挑取阳性克隆子。刮取平板上的菌落，提取质粒。•酵母双杂交系统技术介绍272/3/2020•文库筛选:验证阳性克隆子（PCR确认）25ul2×mix30PCRcycles25ulH2O630497Matchmaker™InsertCheckPCRMix2•酵母双杂交系统技术介绍282/3/2020•文库筛选:酵母质粒提取630467EasyyeastPlasmidIsolationKit•酵母双杂交系统技术介绍292/3/2020•验证互作:体内验证SEAP630305MammalianMatchmakerTwo-HybridAssayKit2•酵母双杂交系统技术介绍302/3/2020•验证互作:体外Co-IP验证MatchmakerChemiluminescentCo-IPVectorSet（630458）MatchmakerChemiluminescentCo-IPKit（630459）ProlabelChemiluminescentDetectionKit（631723）•酵母双杂交系统技术介绍312/3/2020•验证互作:体外Co-IP验证实验流程PL检测•酵母双杂交系统技术介绍322/3/2020•验证互作:FRET分析632466pDsRed-Monomer-C1Vector632470pAcGFP1-C1-Vector•酵母双杂交系统技术介绍332/3/2020•ClontechMatchmaker系统产品选择指南•酵母双杂交系统技术介绍342/3/2020•1.TheFRIGIDAComplexActivatesTranscriptionofFLC,aStrongFloweringRepressorinArabidopsis,byRecruitingChromatinModificationFactorsKChoi,JKim,HJHwang,SKim…-ThePlantCell…,2011-AmSocPlantBiol2.Extracellularsignal-regulatedkinase8(Erk8)controlsestrogen-relatedreceptorα(ERRα)cellularlocalizationandinhibitsitstranscriptionalactivityMRossi,DColecchia,CIavarone,AStrambi…-JournalofBiological…,2011–ASBMB3.WSB-1,anovelIL-21receptorbindingmolecule,enhancesthematurationofIL-21receptorHNara,TOnoda,MRahman,AAraki…-Cellular…,2011–Elsevier4.FHL1interactswithoestrogenreceptorsandregulatesbreastcancercellgrowthLDing,CNiu,YZheng,ZXiong…-JournalofCellular…,2011-WileyOnlineLibrary5.Rab4interactswiththehumanP‐glycoproteinandmodulatesitssurfaceexpressioninmultidrugresistantK562cellsCFerrándiz‐Huertas…-…JournalofCancer,2011-WileyOnlineLibrary6.DuplicatedC-classMADS-boxgenesrevealdistinctrolesingynostemiumdevelopmentinCymbidiumensifolium(Orchidaceae)SYWang,PFLee,YILee,YYHsiao…-PlantandCell…,2011-JpnSocPlantPhysiol7.ProteinInteractionDomainMappingofHumanKinetochoreProteinBlinkinRevealsaConsensusMotifforBindingofSpindleAssemblyCheckpointProteinsBub1andBubR1TKiyomitsu,HMurakami…-MolecularandCellular…,2011-AmSocMicrobiolClontechMatchmaker系统近期参考文献•酵母双杂交系统技术介绍352/3/2020•主要内容•酵母双杂交的背景介绍•酵母双杂交的基本原理•Clontech酵母双杂交系统•常见问题分析•酵母双杂交系统技术介绍362/3/2020•常见问题分析:酵母双杂交文库如何获得？购买Clon