酵母菌的分类鉴定

念珠菌(Candida)等酵母菌的分类和鉴定白逢彦中国科学院微生物研究所Tel:010-62626752E-mail:[e-mail]什么是酵母菌?Yeastsarefungiwithvegetativestatesthatpredominantlyreproducebybuddingorfission,resultingingrowththatiscomprisedmainlyofsinglecells,andwithsexualstatesthatarenotenclosedinfruitingbodies.酵母菌是主要以单细胞形式存在的真菌，以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖，有性生殖阶段不产生子实体。致病酵母菌引起的症状及其生境表层深部人体体外Candidaalbicans阴道炎扩散黏膜少见尿，痰，粪便Candidaguilliermondii耳炎(少见)心内膜炎，联合感染痰，粪便土壤，水Candidakefyr不详扩散痰奶制品Candidakrusei不详扩散痰水，土壤Candidalusitaniae不详扩散痰，粪便动物粪便Candidanorvegensis不详扩散痰，尿水，土壤Candidaviswanathii不详脑膜炎不详不详Cryptococcusneoformans皮肤(少见)肺病，CNS痰(少见)陈鸽子粪，桉树花Malasseziafurfur皮炎肺病皮肤不详Pichiaangusta不详淋巴结不详昆虫，土壤Saccharomycescerevisiae不详扩散痰食品，水果，土壤皮肤，头发土壤，水皮肤，粪便Trichosporonspp.白结节病扩散土壤，水，植物Candidatropicalis腹膜炎，心内膜炎富营养土壤和水Candidaparapsilosisonchomycosis心内膜炎，endophthalmitis阴道炎(少见)痰，尿，粪便代表性感染生境Candidaglabrata阴道炎骨髓炎土壤，水(少见）菌种酵母菌分类95属，723种(TheYeats,aTaxonomicStudy,4thedn.,1998)AccomycetousYeasts(子囊菌酵母)Ascomycota“Archiascomycetes”SchizosacchromycetalesTaphrinalesProtomycetalesPneumocystidalesEuascomycetesSaccharomycetales(11families)BasidiomycetousYeasts(担子菌酵母)TeleomorphictaxaI.With“simple”septalporesA.Basidiacylindric,transverselyseptateUstilaginalesSporidialesPlatygloealesSeptobasidialesAtractiellalesAgaricostilbalesB.Basidiaglobose,nonseptateGraphiolalesC.Basidiacylindric,nonseptateCryptobasidialesExobasidialesBasidiomycetousYeasts(担子菌酵母)TeleomorphictaxaII.Withdoliporesepta,parenthesomecupulateA.Bsidia“cruciate-septate”TremellalesB.BasidiaaseptateFilobasidialesAnamorphictaxaSporobolomycetaceaeCryptococcaeae传统分类方法I.形态特征酵母菌的细胞形态及无性繁殖方式SaccharomycescerevisiaeSaccharomycesparadoxusSaccharomycespastorianusa.单极芽殖(monopolarbudding)：细胞只在一端出芽b.二极芽殖(bipolarbudding)：出芽只局限于母细胞相对的两端c.多边芽殖(multilateralbudding)：出芽发生于细胞上的多个位点d.裂殖(fission)：细胞以横裂的方式进行增殖A.无性繁殖方式abcd酵母菌细胞扫描电镜照片，示芽殖细胞(B)和芽痕(箭头)无性繁殖方式节孢子Arthrospores掷孢子BallistosporesB.酵母菌的有性繁殖子囊菌酵母a.非结合子囊：双倍体的营养细胞直接转化为子囊，如Saccharomyces中的种b.结合子囊：两个单倍体营养细胞结合发生质配和核配，产生双倍体子囊细胞bbbaB.子囊孢子担子菌酵母的有性繁殖双核菌丝的形成担子菌酵母的有性阶段a)萌发的冬孢子(teliospore)b)产生担孢子的担子C.营养细胞的形态特征•酵母菌的营养细胞可呈球形、亚球形、椭圆形、卵形、圆柱形、腊肠形、瓶状、杆状、柠檬形、S曲线形、半月形或三角形等各种形状。营养细胞的形状可反映无性繁殖方式，有时也是属或种的特征，如瓶状细胞是采取单端芽殖的Malassezia属的特征，柠檬形细胞的繁殖方式往往是两端芽殖，三角形细胞是三角酵母属(Trigonopsis)的特征，而Metschnikowialunata和Candidapeltata两个种的营养细胞多呈半月形。D.菌落形态特征•液体培养基中的形态–底部有无沉淀及其质地，表面有无膜醭或岛状醭及其质地，有无菌环•固体培养基上的形态•a.菌落质地：是否为奶酪状，粘液状，松脆状或坚韧状。•b.菌落颜色：常为乳白色或奶油色，但注意是否有黄色，橙色，综色或红色等色调。•c.菌落表面特征：是否返光或暗淡，是否平滑或粗糙，有无纹状，皱拆或疣状突起。•d.菌落边缘：是否平滑(全缘)，波浪状、蚀刻状，根状或流苏状。E.菌丝形成有些酵母菌在进行芽殖时，芽细孢在与母细胞脱离之前连续芽殖，形成丝状体，这种由细胞连续芽殖而形成的菌丝称为假菌丝(pseudohyphae)。有些酵母菌还可形成具分隔的真菌丝，真菌丝是由顶端细胞不断生长并产生分隔形成的。在形态上假菌丝与真菌丝的区别主要为：真菌丝的分隔较直，在分隔处没有缢缩或缢缩不明显，顶细胞往往长于后面的细胞，而假菌丝的分隔只是两个细胞的交接点，弯曲且有明显的缢缩，顶端细胞一般不会长于后面的细胞。II.生理生化特征1.糖类化合物的发酵葡萄糖(glucose)半乳糖(galactose)蔗糖(sucrose)麦芽糖(maltose)乳糖(lactose)棉子糖(raffinose)2.碳源化合物的同化六碳糖：半乳糖，L-山梨糖(sorbose)；五碳糖：D-木糖(xylose)，L-阿拉伯糖(arabinose)，D-阿拉伯糖，D-核糖(ribose)，L-鼠李糖(rhamnose)双糖：蔗糖，麦芽糖，纤维二糖(cellobiose)，海藻糖(trehalose)，乳糖，密二糖(melibiose)；三糖：棉子糖，松三糖(melezitose)；多糖：可溶性淀粉；醇类：赤藓糖醇(erythritol)，核糖醇(ribitol)，D-甘露醇(mannitol)，肌醇(inositol)，甘油(glycerol)，半乳糖醇(galactitol)，D-山梨醇(sorbitolorglucitol)；有机酸：琥珀酸(succinicacid)，柠檬酸(citricacid)，DL-乳酸(lacticacid)；糖苷：杨梅苷(salicin)。3.氮源化合物的同化硝酸盐(nitrate)亚硝酸盐(nitrite)盐酸乙胺(ethylamine.HCl)，二盐酸尸胺(cadaverine.2HCl)L-赖氨酸(L-Lysine)肌酸(creatine)肌酸酐(creatinine)4.在无维生素培养基中的生长情况测试5.温度试验能否在37ºC下生长是酵母菌分类中一个很重要的特征35ºC、40ºC下的生长能力也经常用到最高生长温度III.化学分类特征•辅酶Q(CoQ，泛醌)分子类型Q-6~Q-10，属内一致性化学分类特征•细胞壁(或全细胞)水解液单糖组成木糖XyloseIV.超微结构—细胞壁和芽殖方式Ascomycete-typeBasidiomycete-type超微结构—隔膜(A)Ascomycetetype(B)Basidiomycetetype(C)BasidiomycetetypeV.分子分类和分子系统学DNA碱基组成(DNABaseComposition)属内差异多在10%以内种内差异1.0-1.5%(浮力密度法)或2.0-2.5%(热变性法)DNA-DNA同源性(DNA-DNAHomology)一对菌株的变性总DNA之间杂交复性的程度和稳定性，通常以相对结合百分率表示种内：70%变种间：40-60%种间：40%脉冲电泳核型分析核型(Karyotype)：真核细胞的染色体组成，包括染色体数目、大小、形态结构等人类细胞染色体真菌细胞染色体脉冲电泳(Pulsed-FieldGelElectrophoresis,PFGE)的原理及优势原理：电场不断改变,迫使DNA分子的泳动方向做相应的改变。小的DNA分子比大的变形快，故前者比后者泳动速度快，从而将不同大小的DNA分子分开。优势：分辨率可达10,000Kb(10Mb)以上E1E2YeastcellsProtoplastsAgaroseplug++++ChromosomesKb#2,200XII1,600IV1,125XV,VII1,020XVI945XIII825II785XIV750X680XI610V565VIII450IX365III285VI225ISaccharomycescerevisiaeCHEFelectrophoresisEthidiumbromidestainedgelYNN295CBS2030TCBS7099TJCM9569TCBS5256TJCM9396TAS2.1678TCBS2022TAS2.1681CBS5265TKb220016001125680450225ElectrokaryotypesoftheSixGroupsintheC.guilliermondiiComplexGroup:IIIIIIIVVVIBaietal.2000.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.50:417-422.DNA(或RNA)特定区段的碱基序列测定和比较18S5.8SITS226SITS1D1/D2分子系统学：DNASequencing用于分子系统学研究的基因或DNA区段选择应符合下列要求：1)适当的演化速率；2)单拷贝或至少以单拷贝的方式演化；3)在所有分类群中具有相同的功能；4)了解或可检测其碱基组成和密码子偏好。真菌分子系统学研究常用基因和DNA区段细胞核rRNA基因(rDNA)及其间非编码区SmallSubunit(SSU)rDNA(18S)LargeSubunit(LSU)rDNA(26S,28S)InternalTranscribedSpacer(ITS)IntergenicSpacer(IGS)蛋白编码基因-tublingeneelongationfactor-1α(EF-1α)RNApolymeraseII等等线粒体mitochondrial(mt)DNAmtSSUandLSUrRNAgenesmitochondrialcytochromeb(cytb)cytochromeoxidaseIandII(COXI,COXII)等等SSU5.8SITS2LSUITS1D1/D2IGS2IGS15S050001000015000200002500030000350004000045000ITS26S18SIGSβ-tubulinActinEF-1αRNApolyIImtSSUmtLSUCytbCoxIIGenBank/EMBL/DDBJ核酸序列数据库中收录的真菌分子系统学研究常用基因序列条