14分子标记辅助选择育种

第十四章分子标记辅助选择育种•作物育种：创造变异，选择优良变异•传统育种选择方法：根据植株的表现型选择•缺点：依靠育种家经验；育种年限长；受环境条件影响大（如抗病、抗虫等）•通过与目标性状的基因连锁的、易于识别的性状作为标记，对目标性状进行间接选择（相关选择）第一节分子标记辅助选择的意义•遗传标记：可遗传的、特殊的、易于识别的表现形式•遗传标记类型：形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记•分子标记：直接反应基因组间DNA差异的遗传标记•分子标记辅助选择：通过与目标性状的基因紧密连锁的分子标记来判断控制目标性状的基因是否存在•优点：不需要考虑作物生长条件和环境条件；减少基因互作干扰；快速垒集目标基因，加快育种进程；减少群体种植规模等简称RFLP标记第二节分子标记的类型及原理一、分子标记的类型1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记技术（insituhybridization）限制性片段长度多态性标记（Restrictionfragmentlengthpolymorphisms）可变数目串联重复序列标记（Variablenumberoftandemrepeats）简称VNTR标记原位杂交简称ISH2、基于PCR的DNA标记1）单引物PCR标记2）双引物选择性扩增的PCR标记3）通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记。限制性酶切片段的选择性扩增3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合的DNA标记分为两类PCR扩增片段的限制性酶切如AFLP如CAPsSinglenucleotidepolymorphism，4、基于单核苷多态性的DNA标记单核苷酸多态性简称SNP用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。二、主要分子标记1、RFLP（RestrictionFragmentLengthpo1ymorpams）限制性片段长度多态性1980，Bostein碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶（restrictionenzymes）酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段变化基因组DNA序列上的变化（1）RFLP标记的原理（2）RFLP标记的分析步骤（3）RFLP标记的特点优点①数目几乎无限②共显性③可以利用现有探针，具有种族特异性④RFLP标记遍及全基因组⑥重复性好缺点成本较高;需要许多克隆探针；一个探针只能产生一个多态位点；所需DNA量大(5～15μg)；易造成环境污染随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物（10个核苷酸）。通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。2、RAPD（RandomAmplificationPolymorphismDNA）随机扩增多态性DNA1990,Williams特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性。PCR，聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）Mullis等(1985)PCR反应：变性、复性、延伸。RAPD与经典的PCR反应的区别①引物②反应条件③扩增产物（2）RAPD标记的特点优点1）可检测未知序列的基因组DNA2）引物无种族特异性3）RAPD技术简单4）单个引物可产生几个多态位点5）通过克隆测序可转化成SCARSCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特异序列扩增区域标记缺点1）再现性差2）显性遗传3）存在共迁移问题3、AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms）扩增片段长度多态性1993，Zabeaumarc和Vospieter是对限制性酶切片段的选择性扩增（1）AFLP标记的原理基因组的DNA进行双酶切人工接头连接PCR反应的引物凝胶电泳AFLP扩增数量由酶切频率较低的限制酶在基因组中的酶切位点数量决定。限制性酶酶切频率较高的限制性酶（frequentcutter），酶切频率较低的限制性酶（rarecutter）产生易于扩增基因组DNA限制扩增模板DNA片段的数量3）选择扩增AFLP分析的基本步骤1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA2）DNA片段两端连接上特定的接头(oligonucleotideadapters)6）自显影4）聚丙烯酰胺凝胶电泳5）凝胶转移，干胶处理荧光标记、银染（2）AFLP标记的特点优点1）数目和种类很多2）一次PCR反应可检测多个遗传位点3）AFLP分析模板用量少4）分辨率高5）假阳性低，可靠性高6）AFLP标记多数为显性缺点分析成本高DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高甲基化敏感酶易产生假假阳性(Variablenumbertandemrepeat)4、SSR（SimpleSequenceRepeat）1987，Nakamura生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列可变数目串联重复序列简称VNTR小卫星（minisatellites）微卫星（microsatellites）简单重复序列，又称微卫星DNA一类由1—6个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）nn代表重复次数，其大小在10～60之间微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列（1）SSR标记的原理根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。2）检测一个单一的多等位基因位点。（2）SSR标记的特点1）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高3）多数为共显性标记使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列。4）重复性高，稳定可靠5）需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苛刻引物设计采用2－4个核苷酸序列为基序（motifs），以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基Inter-simplesequencerepeatpolymorphicDNAISSR标记相邻SSR区域内的引物去扩增中间的单拷贝序列共显性遗传5、SCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特异序列扩增区域标记一般步骤RAPD分析克隆片段两端测序设计长为18～24bp的引物PCR扩增检测高的重复性优点6、CAPS（CleavedAmplificationPolymorphismSequence-taggedSite）切割扩增多态序列标签位点技术又称PCR-RFLP基本步骤特定引物PCR扩增PCR扩增产物限制性内切酶酶切酶切产物凝胶电泳检测CAPs标记的优点①引物与限制酶组合非常多②CAPS标记呈共显性③所需DNA量极少④结果稳定可靠⑤操作简便、快捷指基因组中长度为200—500bp，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，可采用PCR技术将其专一扩增出来。7、STS（Sequence-taggedSites）序列标签位点简称序标位YAC或cosmid插入末端序列引物来源RFLP单拷贝的探针序列微卫星序列表达基因序列很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介。8、表达序列标签（Expressedsequencetags，ESTs）表达基因的部分序列共显性遗传突出优点扩增基因开发阅读框（openreadingframes,ORFs）。引物17-18个碱基，包括13-14个碱基的核心区域（5’的10-11个碱基为填充区，随后正向为CCGG，反向为AATT），核心区域后为3个选择碱基。9、SRAP（Sequence-relatedamplifiedpolymorphism）相关序列扩增多态性SRAP的特点优点1）每一反应可得大量多态位点2）不需克隆任何序列，引物可用于不同生物；3）便利、简单；4）重复性好；5）PCR产物可直接测序。基因组中每隔1000个碱基就存在一单碱基差异。一般通过对PCR产物、基因组文库、表达序列标签（EST）文库测序而获得10、SNP（simplenucleotidepolymorphisms）单核苷酸多态性等位基因遗传密码的单碱基差异。特点：数量大AChromosomeMapofTomato第三节重要农艺性状基因连锁标记的筛选一、遗传图谱的构建1、作图群体的建立（1）亲本的选配亲本选择的原则亲本间的DNA多态性丰富；亲本纯度高；杂交后代可育。（2）群体的类型×F1P1P2F2F2群体BC1群体RIL群体是杂交后代经过多代自交而产生的一种作图群体，通常从F2代开始，采用单粒的方法建立。常自交6-7代。重组近交系群体（recombinantinbredlines，RIL）DH群体单倍体经过染色体加倍形成的二倍体一组遗传背景相同或相近，只在个别区段存在差异的株系近等基因系群体（Near-isogeneiclinesNIL）拟测交（Pseudo-testcross）群体复合杂交群体（CP群体）（3）群体的大小构建分子标记骨架连锁图可用小群体150单株或家系。连锁图谱构建的理论是染色体的交换和重组。AABB×abababABABabABba重组率可用来表示遗传图距，重组型配子的最大比例为50%，变化0-50%。图距单位用厘摩（centi-Mergan,cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重组率。2、图谱构建的理论基础两位点存在连锁(r＜0.5)的概率与不连锁的概率(r=0.5)比为确定两位点之间存在连锁，一般要求似然比大于1000，即LOD＞3；而否定连锁的存在，则要求似然比小于100，即LOD＜2。图谱制作的统计学原理①两点测验L(r)/L(0.5)概率之比可用似然比统计量来表示似然函数L()②多点测验检测作图群体的个体（株系）的分子标记基因型P1P2F112345678910111213141516171819202122BHAAHHAHBAAHHHABHABAHH123456789101112••••••3、标记基因型检测4、图谱构建软件利用DNA标记数据，通过作图软件构建连锁图谱。MAPMKER/EXE3.0MapmangerQTX20Joinmap陆地棉（渝棉1号×T586）F2:7群体1、质量性状的基因定位二、基因定位（1）近等基因系分析（2）分离群体分组混合分析111170121351314801421515710CMS育性恢复基因的分子标记控制数量性状的基因051015202530142.0142.0145.0148.0151.0154.0157.0160.0163.0169.0height(mm)Frequency2、数量性状的基因定位数量性状的基因座（quantitativetraitloci,QTL）检验同一标记不同基因型间数量性状均值的差异（1）QTL定位方法1）基于标记的分析方法均值差检测法若差异显著，则表明标记与QTL连锁。BNL1453/200y0.0MUSS099/210t6.3BNL3650/360t(C6)13.0T1(C6)20.2BNL4108/170t(C6)21.6NAU0874/180t22.5MUSS122/200t23.2MUSS501/230t25.9NAU1218/150t(C6)32.7TMB1369/210y43.5BNL2578/200y55.2JESPR252/100t59.1NAU0938/400y63.7NAU1151/210t(C6,C12)68.7TMB0853/250t85.4BNL2569/170y(C6)89.3CIR203/220t(C6)91.5TMB0154/290t(C6)93.2TMB1538/200t96.204Lint05Lint05HLint04Length05Length05HLength04Uniformity05Uniformity05HUniformity04Strength05Strength05InsectChr6陆地棉（渝棉1号×T586）F2:7群体QTL定位2）基于性状的分析方法分离群体分群分析法选择性基因型分析法3、QTL定位软件Mapmaker/QTL1.0MapManage