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分子生物学杨孝朴第七章基因工程1基因工程工具酶2分子克隆载体与宿主细胞3DNA文库建立4目的基因的获得5目的基因与载体的连接7重组体的筛选8克隆基因的表达6重组DNA分子导入受体细胞第七章基因工程基因工程兴起于20世纪70年代初。1972年BergP和他的同事将λ噬菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入猴病毒SV40DNA中，首次构建出DNA的重组体。由于SV40能使动物致癌，出于安全的考虑，这项工作没有进行下去。第二年，CohenS和BoyerH将细菌质粒通过体外重组后导入宿主大肠杆菌细胞内，得到基因的分子克隆，由此产生了基因工程。基因工程是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。基因工程这个术语既可用来表示特定的基因施工项目，也可泛指它所涉及的技术体系，其核心是构建重组体DNA的技术，因此基因工程和重组体DNA技术有时也就成为同义词。1基因工程工具酶1.1DNA限制酶ArberW等早在20世纪50年代就己发现大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制系统，至60年代后期始证明存在修饰酶和限制酶，前者修饰宿主自身的DNA，使之打上标记;后者用以切割无标记的外来DNA。1970年SmithHO和WilcoxKW从流感嗜血杆菌中分离出特异切割DNA的限制性核酸内切酶，简称为限制酶。1973年Smith和Nathans提出修饰一限制酶的命名法：取分离菌属名的第一个字母，种名的前两个字母，如有株名也取一个字母，当一个分离菌中不只一种酶时，以罗马数字表示分离出来的先后次序。修饰性甲基化酶标以M；限制酶标以R。例如，Smith等最初分离到的限制酶因是第2个分离出来的酶，应称为R·HindⅡ，但R通常都省略不写；相应的甲基化酶则为M·HindⅡ。又如，从大肠杆菌E.coilRY13中分离到的甲基化酶为M·EcoRⅠ，限制酶为EcoRⅠ。限制酶的发现为切割基因提供了方便的工具，DNA重组才得以成为可能。修饰一限制酶主要有三种类型：类型Ⅰ酶为多亚基双功能酶，对DNA甲基化和切割由同一酶完成。该酶共有三种亚基，S亚基为识别亚基，识别位点分为两部分序列，中间隔以一定长度的任意碱基对。例如，EcoB识别序列为TGAN8TGCT，EcoK识别序列为AACN6GTGC。M亚基具有甲基化酶活性，R亚基具有限制酶活性，可在远离识别位点至少lkb以上处随机进行切割。当类型Ⅰ酶特异结合在识别位点上时，如果两条链均已甲基化则不发生反应，对半甲基化DNA（即一条链甲基化，另一条链末甲基化），可使末甲基化的链甲基化，在识别位点上两条链均末甲基化，则DNA被酶切割。由于切割是随机的，这类酶在基因操作中并无实际用途。类型Ⅱ酶的修饰和限制活性由分开的两个酶来完成。通常这类甲基化酶由一条多肽链组成，限制酶由两条相同的多肽链组成。类型Ⅱ酶的识别序列常为4～6bp的回文序列。甲基化酶能使半甲基化DNA识别位点上特定碱基甲基化，DNA两条链都已甲基化时无反应，两条链都末甲基化则被限制酶降解。限制酶的切割位点或在识别位点内，或靠近识别位点。类型Ⅱ酶是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶。类型Ⅲ酶为两个亚基双功能酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责切割。切割位点在识别位点下游24～26bp处。大部分限制性核酸内切酶识别的DNA序列具有回文结构特征，不同的限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种不同的情况：①产生5′突出黏性末端：以EcoRⅠ为例：5′-CTGCA3′5′G-3′3′-G5′3′-ACGCTC-5′5′-G↓AATTC-3′3′-CTTAA↑G-5′5′-G3′5′-AATTC-3′3′-CTTAA5′3′G-5′②产生3′突出的黏性末端：以PstⅠ为例：5′-CTGCA↓G-3′3′-G↑ACGTC-5′③产生平末端：以KpaⅠ为例：5′-GTT↓AAC-3′3′-CAA↑TTG-5′5′-GTT3′5′AAC-3′3′-CAA5′3′TTG-5′由不同微生物分离得到的限制酶，如果识别位点和切割位点完全一样，称为同裂酶；如仅仅是黏性末端突出的单链相同，称为同尾酶。由同尾酶切割的限制片段彼此相连，不能再被原来的限制酶切割。例如：BamHⅠ的位点与限制片段BglⅡ的位点与限制片段连接后的序列与原来两个限制酶的识别序列均不相同，因此不能再为原来的酶所切割。G↓GATCCCCTAG↑GA↓GATCTTCTAG↑AGGATCTCCTAGA限制酶的生物学功能在于降解外来的DNA，自身DNA的酶切位点由于修饰酶的甲基化而受到保护。在基因工程操作中限制酶可作为切割DNA分子的手术刀，用以制作DNA限制酶谱，分离限制片段，进行DNA体外重组等，是十分有用的工具酶。限制片段常用凝胶电泳或高效液相层析（HPLC）法分离。如果DNA中的核苷酸序列是随机排列的，则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔隔256bp出现一次该酶的识别切割位点（44），识别六或八核苷酸序列的内切酶则大致上分别是每隔4kb（46）或65kb（48）出现一次识别切割位点。按此可大致估计一个未知的DNA分子限制性内切酶可能具有的切点频率，以便选用合适的内切酶。1.2DNA连接酶DNA连接酶可将DNA相容末端彼此连接。实验室使用的DNA连接酶有两种，T4DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶，前者以ATP提供连接所需能量，后者以NAD+提供能量。T4DNA连接酶可以连接黏性末端，也可以连接平末端；大肠杆菌DNA连接酶只连接黏性末端。因此，DNA连接反应常用T4DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶使用较少。互补黏性末端之间碱基配对使连接反应容易进行，但平末端之间连接反应效率很低，为提高平末端连接效率常采取以下措施：①提高T4DNA连接酶浓度；②提高DNA片段浓度；③降低ATP浓度，以增强连接酶与DNA的结合；④加入多胺化合物，如亚精胺，降低DNA的静电排斥力；⑤加浓缩剂，如大分子排阻物聚乙二醇(PEG)、强水化物三氯化六氨钻等。DNA片段两末端若为相容黏性末端或平末端，连接时可以发生分子间串联，或是分子自身环化。此两过程以何者占优势取决于DNA片段的链长与浓度，DNA链较短，浓度较低，有利于自身环化;反之，链较长，浓度较高，有利于分子间串联。在DNA的末端加上一段限制性内切酶的识别序列，随后用限制酶切出所需要的黏性末端，使DNA的平端连接得以转变成为较易进行的黏性末端连接。此合成的含限制酶识别序列的DNA片段称为接头。接头通常是一条回文结构的寡核甘酸，在溶液中自身配对成为双链片段。例如，EcoRⅠ的接头为GGAATTCC；HindⅢ的接头为CCCAAGCTTGGG。通常限制酶的接头要比识别序列长一些。当合成的片段含有不只一种限制酶的识别序列，则称为多接头。如果合成两条互补的寡核苷酸，使其配对后一端为平末端，另一端为黏性末端，或两端为不同的黏性末端，此合成的片段称为衔接物。衔接头可以使DNA片段的平末端转变为黏性末端，或由一种黏性末端转变为另一种黏性末端，并且无需用限制酶切，在基因工程中十分有用。例如：EcoRⅠ-SmaⅠ平末端衔接头5′-AATTCCCGGG-3′3′-GGGCCC-5′EcoRⅠ-XmnⅠ-BamHⅠ衔接头5′-AATTCGAACCCCTTCG-3′3′-GCTTGGGGAAGCCTAG-5′在需要连接的两个DNA片段末端加上互补的均聚核苷酸后，连接反应比较容易进行。末端核苷酸转移酶能催化DNA末端3′-OH上添加脱氧核苷酸。如果在一个DNA片段的末端添加寡聚dT，在另一片段末端添加寡聚dA；或者分别添加寡聚dC和寡聚dG，这样两个片段末端可以“粘合”。然后用DNA聚合酶（常用DNA聚合酶Ⅰ的大片段Klenow酶）填补缺口，最后由T4DNA连接酶连接（见图）。另外的一种连接方式是粘平末端的连接，即要连接的DNA片段的一端为粘端、另一端为平端。产生“粘-平”方式的末端有两条途径，即用一个产生平性末端的限制性内切酶（如SmaⅠ，HpaⅠ）与一个产生粘性末端（如EcoRⅠ,BamHⅠ）的内切酶切割目的基因与载体；或先用一个产生粘性末端的内切酶酶切DNA，然后用修饰酶补平或消平粘性末端，使之成为平末端，再用另一个产生粘性末端的内切酶酶切该DNA，以这种方式连接得到的重组子，其目的基因可定向插入载体，并避免了载体分子的自身环化。1.3其它工具酶DNA聚合酶Ⅰ：DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合、3′→5′外切和5′→3′外切酶活性。5′→3′外切酶活性可降解DNA模板上引物的5′端等，使用起来不方便，故出现了从全酶中去除5′→3′切酶活性的Klenow片段。该酶常用于测序、探针标记等。TaqDNA聚合酶：TaqDNA聚合酶使是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。最佳作用温度为72℃～80℃。常用于PCR反应和测序反应。逆转录酶：反转录酶是以RNA为模板的DNA聚合酶。常用于合成互补DNA（cDNA）。T4多核苷酸激酶：T4多核苷酸激酶的功能是催化将ATP上的γ磷酸基团转移到DNA的5′端上。常用于探针的末端标记。碱性磷酸酶：常用的碱性磷酸酶有两种,从细菌分离出来的碱性磷酸酶（BAP）和从牛肠道分离出来的牛小肠碱性磷酸酶（CLAP）。其功能都是从DNA、RNA或核苷酸上的5′端将磷酸水解下来。常用在文库建立和探针标记中。T7、T3、SP6RNA聚合酶：这些酶的作用是以DNA为模板合成RNA片段，但模板要求具有相应的启功子序列。常用于合成RNA探针、体外翻译等。2分子克隆的载体与宿主系统将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具称为载体。克隆载体含有在受体细胞内复制的起点，因此可以自主复制，是一个复制子。克隆载体，通常是由质粒、病毒或一段染色体DNA改造而成。细菌与真菌的克隆载体常用质粒来构建，只对特殊的要求才用噬菌体构建。动、植物的基因载体更多是用病毒或染色体DNA构建。理想的克降载体应具备以下特征（基本要求）：①能自主稳定复制，目的基因的插入基本不影响载体的复制能力。②容易进入宿主细胞，并在细胞中可以有较高的拷贝数。③应具有一个以上的限制酶单一位点（多个酶位点时称为多克隆位点），以便目的基因插入，并且不因为含外源片段而改变其本身基本特性。④具有某些容易检测的遗传标记（如抗药性、氨基酸合成酶、空斑形成等），以便利用这些标记筛选克隆。⑤插入目的基因的幅度较宽。⑥除保留必要序列外，载体应尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖。⑦从生物防护角度考虑是安全的。从安全性上考虑，克隆载体应只存在有限范围的宿主，在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。此外，根据不同目的还有各种特殊的要求。构建载体时，通常需选择适当质粒、病毒或染色体复制子作为起始物质，删除其中非必需序列，然后插入或融合选择标记序列。最常用的选择标记是对抗生素的抗性基因，如抗氨苄青霉素（ampr）、抗四环素（tetr）、抗氯霉素（cmlr）及抗卡那霉素（kanr）等。利用营养缺陷型宿主可以将相应生物合成基因作为标记，带有合成基因的载体可使宿主细胞在基础培养基中生长，无需补充原来所缺的营养成分。当载体过大时，常用限制酶将其切成小碎片，再随机连接，并用选择培养基选出带有抗性、拷贝数多、长度较小的载体，此过程称为分子重排。在构建载体时保留一些限制酶的切点可作为外源DNA插入位点。现常用一段合成的多接头插入载体，其上十分紧凑地排列着多种限制酶的单一识别序列，因此在用限制酶切时不致将载体切成碎片。对于载体上不合适的则需要用定位诱变的方法予以改造。质粒是使用最早和最广泛的克隆载体。从20世纪70年代初基因工程诞生至今约30多年，克隆载体的发展大致可分为三个时期：第一个时期，主要依赖天然存在的质粒，如1973年Cohen等最早使用的载体pSC101。1977年Bolivar等从天然存在的质粒出发，经删除、融合、转座及重排等操作，构建成功适合多种用途至