分子生物学在医学研究中的应用

分子生物学在医学研究中的应用临床医学研究中心分子生物学概念及研究内容分子生物学是从分子水平上研究生物大分子的结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学。研究的主要内容为核酸（DNA，RNA）和蛋白质。分子生物学的形成过程1865年达尔文《物种起源》：性状可遗传1865年孟德尔遗传性状的单位称为基因1869年米歇尔首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA1879年弗莱明发现了染色体1902年萨顿提出了染色体遗传学说并认为基因是染色体的一部分1910年摩根证明了基因存在于染色体上1944年艾弗里证实了DNA是构成染色体的大分子.1953年Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构.1958年M．Meselson和F．W．Stahl提出了DNA半保留复制模型.1965年，霍利完成了第一个酵母丙氨酸tRNA的核苷酸全序列测定.1966年，尼伦伯格，霍利,科拉纳共同破译了全部的遗传密码.1972年，博伊等人发展了重组DNA技术1975年，Sanger等人发明了快速的DNA序列测定技术.医学的概念及主要任务医学是生命科学的重要组成部分，是在人类祖先自我防护本能的基础上，通过长期的劳动实践和抗病害斗争而形成和发展起来的一门科学。医学的主要任务是防治疾病、保障健康和延年益寿。传统医学主要解决人类出现的异常和疾病现象。现代医学是随着科学技术的进步和社会的发展，在基本解决传统医学，即常见疾病防治的基础上，逐渐转变为探讨生命和疾病现象的本质。现代医学不是单单研究一个个事物，一个个现象，而是研究事物、现象的变化发展过程，研究事物相互之间的关系。由“整理材料”的科学，发展成为严密综合起来的体系。20世纪医学的特点是：一方面向微观发展---分子医学；一方面又向宏观发展---系统医学。医学研究的发展过程细胞水平：19世纪的细胞学和微生物学分子水平：80年代的生物技术和分子生物学量子水平：21世纪后从微观水平逐步阐明生命和疾病现象的本质基因克隆、扩增、测序为基础的分子生物学技术已广泛应用于基础医学，以及疾病的发病机理、诊断及治疗。PCR技术的出现使人们能在体外快速大量的扩增目的DNA，并将此技术应用于病原微生物及特点基因的诊断—基因诊断。遗传突变致病基因的发现为阐明遗传病的发病机理提供了条件，并为基因治疗提供了靶点及方向。分子生物学技术的发展促进了该技术在生物学、细胞生物学、医学等领域的渗透与融合，反过来分子生物学技术与其他学科的结合又产生了新的分子生物学技术。后面的同学，掌声在哪里~分子生物学在医学研究中的应用PCR及基因突变检测技术基因敲除(Knockout)及替换(Knockin)技术遗传病相关基因的研究人类基因组计划基因芯片技术转基因动物技术动物克隆技术从鼠源性到人源性抗体利用酵母菌双杂合系统确定相互作用的蛋白质一.PCR及基因突变检测技术聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)简称PCR。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病与病原体微生物的诊断等。由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。基因突变（genemutation）是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改变，而引起的基因结构的改变。基因突变包括插人、缺失及替换几种类型。一般基因突变是有害的，但是有极为少数的是有益突变。例如一只鸟的嘴巴很短，突然突变变种后，嘴巴会变长，这样会容易捕捉食物或水。某些基因突变会导致编码蛋白质结构异常并最终致病。异常血红蛋白病(abnormalhemoglobin)：由于珠蛋白基因突变，导致合成的珠蛋白肽链的结构和功能异常导致的疾病。异常血红蛋白病发病机制：单个碱基替换、移码突变、整码突变、融合基因、终止密码突变、无义突变。镰状细胞贫血Betachain6GluValA→T基因突变的检测对遗传相关疾病的检测及发病机理研究非常重要。基因突变检测方法目的基因PCR产物的限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分析随机扩增长度多态性(AFLP)分析单链构象多态性(SSCP)分析1～4、7～9：野生型基因片段；5、6：两例Val384Asp携带者的样本，显示变异的SSCP带型目的基因PCR产物的限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、随机扩增长度多态性(AFLP)、单链构象多态性(SSCP)等结合DNA序列测定技术是分析基因突变的有效方法。等位基因：C/G,杂合型二.基因敲除及替换技术生物体内有些基因发生突变，其功能可被其它成份替换而不导致重要生理功能异常该生物体能够存活或发育，而有些基因突变时可导致严重的生理功能异常使生物体死亡。通过将目的基因从染色体中去除或破坏而观察该基因的生理作用称为基因敲除(Knock-out)；通过将目的基因插入染色体中而观察该基因的作用称为基因替换（Knock-in）。基因敲除基本步骤先将有选择性标记基因(通常为neor基因)克隆到基因载体上，载体上含有与胚胎干细胞基因组中目标位点同源的序列。将上述载体转染Es细胞基因后通过G418筛选同源重组后的Es细胞，将筛选出的Es细胞再用含有突变基因的载体转染，通过同源重组使突变基因置换选择基因，再筛选出含有突变基因的Es细胞。将含有突变基因的Es细胞通过直接注射入小鼠囊胚或与小鼠叠模胚共同培养使Es细胞进入受体小鼠胚胎然后将这种囊胚移植到假孕小鼠子宫让其发育。长成的小鼠为杂合子代小鼠(heterozygote)，这种小鼠靶基因的一个等位基因是正常的，另一个基因则发生了人为的改变。再通过回交选择出两个拷贝都发生了变化的纯合基因小鼠。基因替换将含选择性基因与含有突变的目的基因一起克隆到酵母菌质粒载体上，经扩增后，将上述基因从载体上用合适的酶切下来或与质粒一起转化酵母菌二倍体，含有选择基因的突变目的基因将通过同源重组或整合到酵母菌的染色体中，通过细胞分裂及选择性培养可获得含有基因突变的细胞株。可通过上述类似的方法将目的基因置换或融合到人酵母菌的染色体中。基因敲除技术的应用1.基因敲除可用于建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料。1992年成功建立了囊性纤维化病(CF)的致病基因(CFTR)基因敲除的CF小鼠模型，为CF基因治疗提供了很好的动物模型，得以顺利通过了基因治疗的动物试验，于1993年开始临床试验并获得成功。2.基因敲除可用于异种器官移植。通过将引起排斥反应的基因敲除，为动物成为人体器官的有效供体提供了可能。3.基因敲除可用于治疗遗传病等，包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗目的。4.基因敲除技术可用于免疫学。同异源器官移植相似，如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。5.基因敲除技术还可用于改造生物，培育新的生物品种。三.遗传病相关基因的研究随着分子生物学、遗传学的发展，越来越多的与疾病有关的基因被克隆分离出来。与遗传相关性疾病可分为单基因遗传病与多基因遗传病。前者指疾病的发生是由一个特定基因突变所致，后者指多种基因突变才能导致疾病和发生。目前克隆并分离出最多的是单基因遗传病。而绝大多数常见的对人类危害极大的多基因遗传病基因的定位与克隆则成为当前医学遗传分子生物学研究的重点与难点课题之一。在遗传病相关基因定位领域常用的方法有受孕同胞对法(ASP法)，受孕家系成员法(APN法)，连锁分析法与连锁不平衡分析法等。连锁分析与连锁不平衡分析这两大基本原理是所有这些方法的基础。连锁分析的基本原理在家系中，位于同一条染色体上的两个位点(致病基因与遗传标记)在减数分裂的过程中会发生交换与重组。重组率越高，两个位点在一起传给后代的机会就越少，通过对覆盖密度适当的遗传图中遗传标记物(marker)在家系中进行分型(genotyping)，以此找到与致病基因紧密连锁的某一标记物，从而确定该基因在染色体上的粗略位置。在此基础上再在该染色体区域使用覆盖程度更高的标物作深入的连锁分析就可将致病基因确定在较少的区域，这样再利用物理图提供的该区域的染色体片段将基因确定或克隆。连锁不平衡分析的原理来自同一祖先的致病突变基因，在经历多代减数分裂后与致病基因连锁的标记基因多次重组而逐渐与致病基因间趋于平衡，离致病基因越远的标记，二者趋于平衡的趋势越大，离致病基因越近的标记，由于重组率低与疾病就处于不平衡即紧密连锁的状态。这样在该基因发生突变后，它与其周围标记构成的单体型(haplotype)就会逐渐被新的单体型所取代，保持不变的单体型就越来越短。利用这种原理，只要建立该疾病群体中患者与亲代的单体型，根据整个单体型的改变就可以找到与致病基因有关紧密连锁的标记物，从而将该基因定位。四.人类基因组计划人类基因组计划(HumanGenomeProject,HGP）是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。测序方法：分级霰弹枪测序法人类基因组图谱人类22号染色体基因组计划是人类为了探索自身的奥秘所迈出的重要一步，是人类科学史上的又一项伟大工程。截止到2005年，人类基因组计划的测序工作已经基本完成（92%）。今天，人类DNA序列已经存储在数据库中，任何人都可以通过互联网下载。美国国家生物技术信息中心和位于欧洲和日本的相关组织储存着整个基因序列，其中包含已知序列，假设基因和蛋白质。塞雷拉人类基因组计划塞雷拉人类基因组计划，在国际人类基因组计划启动八年后的1998年，美国科学家克莱格·凡特创办了一家名为塞雷拉基因组（CeleraGenomics）的私立公司，开展独立的人类基因组计划。因为塞雷拉基因组的竞争促使国际人类基因组计划不得不改进其策略，进一步加速其工作进程，使得人类基因组计划得以提前完成。测序方法：霰弹枪测序法（鸟枪法）人类基因组计划的应用破译人类遗传信息，将对生物学，医学，乃至整个生命科学产生无法估量的深远影响。目前基因组信息的注释工作仍然处于初级阶段。随着将来对基因组的理解更加深入，新的知识会使医学和生物技术领域发展更为迅速。人类基因组计划为疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础，推动了亨廷顿舞蹈病、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现。目前对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重点。事实上，在人类基因组计划完成之前，它的潜在使用价值就已经表现出来。大量的企业，例如巨数遗传公司（MyriadGenetics）开始提供价格适宜，而且容易使用的基因测试，其声称可以预测包括乳腺癌、凝血、纤维性囊肿、肝脏疾病在内的多种疾病。人类基因组计划对许多生物学研究领域有切实的帮助。例如，当科研人员研究一种癌症时，通过人类基因组计划所提供的信息，可能会找到某个或某些相关基因。如果在互联网上访问由人类基因组信息而建立的各种数据库，可以查询到其他科学家相关的文章，包括基因的DNA、cDNA碱基顺序，蛋白质立体结构、功能，多态性，以及和人类其他基因之间的关系。也可找到和小鼠、酵母、果蝇等对应基因的进化关系，可能存在的突变及相关的信号传导机制等。分析不同物种的DNA序列的相似性会给生物进化和演变的研究提供更广阔的路径。事实上，人类基因组计划提供的数据揭示了许多重要的生物进化史上的里程碑事件。如核糖体的出现，器官的产生，胚胎的发育，脊柱和免疫系统等都和DNA载有的遗传信息有密切关系。五.基因芯片技术生命的遗传信息贮存于DNA碱基序列中，人类基因组计划已得到人类3x109bP全序列。这些DNA序列的生物学意义是什么，在疾病状态下这些DNA序列会出现什么样的变化都是非常重要的研究课题，DNA芯片技术的出现为解决上述问题提供了方法。基因芯片技术的基本原理根据DNA碱基互补特异结合原则，利用DNA探针的特异性、灵敏性，通过将特