分子生物学实验技术

1第五章分子生物学实验技术实验21大鼠肝组织DNA的提取及其含量测定【原理】DNA以核蛋白形式存在于细胞中，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。DNA的提取方法较多，根据实验用途可简可繁。这里介绍一种经济简便不用蛋白酶K提取真核细胞DNA的方法。在DNA抽提缓冲液中，加入SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；加入EDTA可抑制DNase活性，减少DNA降解。分离出来的DNA用酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染，最后用无水乙醇沉淀DNA。260nm处DNA有最大吸收峰，利用该原理测DNA的A260，可计算其浓度。【试剂】1．生理盐水。2．TE缓冲液(pH8.0)含10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)，以103.4Kpa高压蒸汽灭菌，4℃贮存。3．10%SDS固体SDS10g，加双蒸水70ml于42℃水浴溶解，用双蒸水定容至100ml。4．Tris-HCl饱和重蒸酚(pH8.0)将市售的苯酚置于65℃水浴中溶解，用空气冷凝管进行重蒸馏，当温度升高至183℃时开始收集于数个棕色瓶中(每瓶约200ml)，贮存于－20℃可保存数年。使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至65℃水浴融化(冰箱取出后勿立即放入65℃水浴中，以防玻璃炸裂)。融化后加8-羟基喹啉至终浓度为0.1%(w/v)，溶解混匀，此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的1mmol/LTris-HCl(pH8.0)，立即加盖，剧烈振荡并加入固体Tris摇匀(一般加1g固体Tris/100ml酚)。静置分层后从分液漏斗中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，剧烈振荡，直至酚相pH＞7.8，将酚装入棕色试剂瓶中，加入0.1倍酚体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)覆盖酚相，置4℃贮存备用。由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买Tris-HCl饱和重蒸酚。5．氯仿/异戊醇(24:1，v:v)均为分析纯。6．10mol/L醋酸铵。7．无水乙醇(AR)。8．10mg/mlRNaseA称取RNaseA10mg溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl2中，于100℃加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃。如为Sigma公司产品，一般则不需加热煮沸。【操作步骤】1．迅速处死大鼠，立即取出肝脏约1g，用冷生理盐水洗去附着的血液，滤纸吸干后放入玻璃匀浆器，加入5ml冷TE缓冲液制备匀浆。2．取1ml匀浆液倒入小试管中，加入10%SDS溶液0.1ml，颠倒混匀后，室温10min，溶液变粘稠。3．取饱和酚0.5ml，氯仿：异戊醇(24：1)0.5ml，混合后加入上述溶液中，充分混匀，室温放置10min，其间不断摇动保持溶液呈乳状，3000r/min离心10min。4．小心取出上层水相至小试管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，3000r/min，离心5min。5．小心取出上层水相转移到新试管，加入0.3倍水相体积的10mol/L醋酸铵，2.5倍水相体积的无水乙醇充分混匀，纤维状DNA即从溶液中析出。6．用吸管小心取出纤维状DNA，转移到1.5ml离心管，3000r/min，离心5min，小心倒去溶液，用滤纸吸干。7．加1ml蒸馏水和5μl浓度为10mg/ml的RNaseA溶解DNA沉淀，室温放置20min。如DNA难于溶解，可置于56℃水浴20～30min，并不断摇动，直至溶解。8．DNA的含量测定：取0.5mlDNA样品和蒸馏水3.5ml至石英杯中，用蒸馏水调零，在752紫外分光光度计上测A260值和A280值。【计算】1．DNA浓度(μg/ml)＝A260nm×50×4÷0.52．A260nm/A280nm比值【注意事项】1．剧烈振荡可使DNA断裂，因此操作中不能用电动振荡器混匀。2．如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。3．根据DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有一吸收峰的原理，可测定A260nm/A280nm比值检测DNA的纯度，该比值接近1.8～2.0表示蛋白质污染极少。4．制备重蒸酚和平衡酚过程中应戴手套，防止灼烧皮肤。附：外周血细胞DNA的快速提取3【原理】从全血制备白细胞DNA可用非离子去污剂NP40和低盐缓冲液直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，通过离心获得白细胞的细胞核，向核悬液中加入SDS破裂核膜，并使DNA从核蛋白中解离，溶解在一定浓度的NaCl中，经乙醇沉淀即可得到DNA。缓冲液中Mg2+的浓度对于获得完整的高分子量DNA十分重要，本实验低盐缓冲液中Mg2+浓度是4mmol/L，如超过10mmol/L可导致DNA的降解。缓冲液中的EDTA可抑制DNA的降解。【操作步骤】1．取0.5ml外周血置于1.5mlEppendorf(EP)管中，EDTA-Na2抗凝(每管预先加入0.3mol/LEDTA-Na230μl)，3000r/min离心5min，弃血浆，得沉淀部分。2．加0.5ml低盐缓冲液(10mmol/LTris-HCl，pH7.6，10mmol/LKCl，4mmol/LMgCl2，2mmol/LEDTA)，12.5μl的20%NP40，振荡破碎红细胞，5000r/min离心5min，弃上清。3．用低盐缓冲液洗白细胞2次(每次5000r/min离心5min)，弃上清。4．加入250μl低盐缓冲液，20μl的10%SDS，混匀，50℃水浴温育10min。5．加入100μl饱和NaCl(称取4g氯化钠，溶于10ml蒸馏水中即成)，剧烈振荡2min，4℃，12000r/min离心10min。6．吸上清于另一干净EP管中，加入1ml预冷的无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心2min，弃上清。7．加1ml预冷的70%乙醇洗涤DNA2次，12000r/min离心2min，弃上清，将EP管倒置于滤纸上，室温干燥。8．加250μlTE缓冲液溶解DNA，紫外定量，4℃冰箱保存备用。【评价】本实验可在不到1h内快速提取高质量未降解的全血DNA。实验提取的全血DNA贮存在室温或37℃温育24h与冻存在－70℃的DNA质量一样，但DNA反复冻融4次以上可导致部分降解。本实验可用于提取少至10μl全血样品(可获得340ng左右DNA)或干燥的血液样品，因此本实验适用范围较广。实验22碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒DNA从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。目前常用的有碱裂解法(又称碱变性抽提法)、羟基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法、两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上方法各有利弊。但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂解法效果良好，经济且收率较高，是一种使用最广泛的制备质粒DNA的方法，也是当今分子生物学研究中的常规方法。制备的质粒DNA可用于酶切、连接、转化以及PCR等。【原理】碱裂解分离质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。当细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，4加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒DNA又恢复到原来的构型留在上清中，再经酚/氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒DNA。质粒DNA的存在形式有3种：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②开环DNA，此种质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂；③线性DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒DNA的3种形式泳动速度：超螺旋＞线性＞开环。【试剂】1．菌种含pBR322或其他质粒DNA的大肠杆菌工程菌如HB101，DH5α，JM109等，如实验后需直接酶切制备的质粒DNA，可选用科研工作中用EcoRⅠ非定向克隆构建的重组质粒DNA转化的大肠杆菌。2．LB液体培养基称取胰蛋白胨3.0g，酵母提取物1.5g，NaCl3.0g，加双蒸水200ml溶解，用5mol/LNaOH调至pH7.4，定容至300ml，转移至三角烧瓶中，以103.4Kpa高压灭菌20min。3．10mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液在无菌条件下配制，－20℃贮存备用。4．含Amp的LB固体培养基每100mlLB培养液在临高压灭菌前加入1.5g琼脂，以103.4KPa高压灭菌20min，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至50℃(用手背碰一下瓶壁不致烫手)，方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/mlAmp溶液1ml，使其终浓度为100μg/ml，然后在超净台上铺平板，90mm直径的培养皿约需25ml培养基。5．Tris-HCl饱和酚(pH8.0)与TE缓冲液同实验21。6．溶液Ⅰ含50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na2，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，临用前加溶菌酶至2mg/ml。7．溶液Ⅱ含200mmol/LNaOH，10g/LSDS，临用前用两种溶液的贮存液配制。8．溶液Ⅲ5mol/L醋酸钾溶液60ml(称取29.4g醋酸钾定容至60ml)，冰醋酸11.5ml和双蒸水28.5ml混合而成。9．10mg/mlRNaseA同实验21。10．50×TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸馏水至100ml。1×TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。11．溴酚蓝指示剂溶液(6×上样缓冲液)称取溴酚蓝100mg，加双蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50ml，加入NaOH1滴，调至蓝色。512．1mg/ml溴化乙锭(EB)戴手套谨慎称取EB20mg于棕色试剂瓶中，加20ml双蒸水，溶解后贮于4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每100ml凝胶加50μlEB。13．DNA分子量标准根据需要购买，一般浓度为0.5μg/μl。13．其他试剂氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、异戊醇。【操作步骤】1．用接种环挑取1环冷冻保存的含质粒DNA大肠杆菌工程菌，划线接种于含有Amp的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养约12h(过夜)。2．用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有2mlLB液体培养基(含100μg/mlAmp)的试管中，37℃摇荡培养过夜。3．将菌液收集在1.5ml的EP管中，10000r/min离心2min，弃上清，将离心管倒置于一纸巾上，以使所有液体流出。4．在沉淀中加入溶液Ⅰ100μl，涡旋混匀，静置5min。5．加入新鲜配制的溶液Ⅱ200μl，颠倒数次，轻轻混匀，冰浴5～10min(溶液变透明，粘稠)。6．加入溶液Ⅲ150μl，颠倒混匀，冰浴5～10min(溶液出现白色沉淀)。7．12000r/min离心2min，将上清转移至另一EP管中。8．加等体积酚抽提1次，12000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。9．加等体积氯仿/异戊醇(24：1，v/v)抽提1次，12000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。10．加入2倍体积无水乙醇振荡混匀，于室温放置2min沉淀DNA。12000r/min，离心5min，弃乙醇。11．用70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心5min，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或真空干燥。12．用50μl含RNaseA的TE缓冲液溶解DNA沉淀，振荡，室温放置20min。13．制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分