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实验内容：SDS碱裂解法提取质粒具体方法：(1)取菌液1.5mL至离心管中，12000rpm离心5min，弃上清。(2)加入100ul溶液1，充分悬浮菌液；(3)加入200ul溶液2，上下颠倒5次，冰上3min；(4)加入150ul溶液3，轻晃10s，冰上3~5min；(5)12000g离心10min，将上清移至新试管；(6)加2倍体积异丙醇混匀，室温静置10min；(7)12000g离心5min，去掉上清；(8)自然干燥沉淀，加30ulTEbuffer，取3-5ul酶切电泳鉴定，剩余-20ºC保存。改进之处：不使用酚/氯仿，时间变短注意事项：无自己的实验感想：与采用分子克隆中的方法所得结果没有区别。感谢参与，已奖励威望2，金钱50，经验50！但是有几个问题：(8)自然干燥沉淀，加30mLTEbuffer，取3-5mL酶切电泳鉴定，剩余-20ºC保存。，单位是否有问题！sorry，应该是微升，原文已经改了实验内容：大肠杆菌感受态细胞制备具体方法：1.挑一单菌落接种与20mlLB，过夜2.按1%（v/v）接种于新鲜培养基，210rpm，约2.5h，至OD.600=0.4。冰浴10min3.分装于1.5ml预冷EP管，室温离心12，000g，20sec。无菌操作，去上清。4.每管用1ml预冷0.1MCaCl2(含10%甘油)重悬；冰浴5min；室温离心12，000g，20sec。无菌操作，去上清。5.每管用100ul预冷0.1MCaCl2(含10%甘油)重悬；-70度保存备用。改进之处：无须低温离心；适合与没有冷冻离心机的实验室。注意事项：尽量减少在室温放置的时间有利于提高感受效率。自己的实验感想：由于实验室没有大型冷冻离心机，改进后可以不用跑到公共实验室了：）感受态效率不错，不低于常规方法制作的感受态效率质粒DNA的提取纯化（碱法）1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于20μlTE缓冲液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，储于-20℃冰箱中。[注意]1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。实验内容：重组子鉴定（菌落PCR）具体方法：1.PCRmixture的制备Taqbuffer(10*)20uldNTP(2.5mM)5ulPrimerupward(50nM)10ulPrimerdownstream(50nM)10ulddH2O147ulTaq(2U/ul)8ul--------------------------------------------total200ul将上述溶液混匀，10ul每管分装与200ulPCR管中。2.常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB-Agar平板上轻点，做一copy；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCRmixture的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。3.将混有菌体的PCRmixture置PCR仪按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。4.将已经接种有菌落的平板置37度培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果使早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。改进之处：节省了常规酶切鉴定耗时费力的缺点。同时加快了试验进程。本人曾经用三天时间完成了一个克隆的构建并表达：第一天早上PCR扩增目的基因，同时抽提载体的质粒；中午酶切，下午连接转化；第二天早上鉴定摇菌，下午抽提质粒转化（转到BL21(DE3)中）；第三天诱导表达。注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低：）不过要注意PCR条件的选择，接近最佳犹佳。同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。自己的实验感想：试验就像游戏，多尝试就会有新发现：）CompetentBacteriafortheOneMinuteTransformationMethodPreparationofcompetentcells:1.GrowcellsovernightinLBat37℃.2.Incubatein1literofLBwith10mloftheovernightcultureandgrow1to1.5hourat37℃toOD595=0.5.3.Splitintotwo500mlprechilledsteriledpolypropylenetubesandcentrifugeinSS-34rotor@3500rpmfor10min,resuspendin200mlofTsfⅠeach(icecold).Donotusepipettes,resuspendbyswirlinginanicebucketatnearlyhorizontalleveronshakerincoldroom,handswirloccasionaltospeeduptheprocessandmakesurenocellchunksleft.4.CentrifugeinSS-34rotor@3500rpmfor10min,resuspendin20mlofTsfⅡeach(icecold).5.Aliquotcellsinconvenientsizes(550μlpertube)andfreezeinliquidN2.(Note:freezingprocedureisnecessaryforhighestcompetency).6.Storeat-70℃.Transfromationofcompetentcells:Thawcompetentcellsonice,aliquot50to100μl/tube.AddDNAandheatshockat37℃(or42℃)for1min.Plate.(Note:Keeponicebeforeandafteraslongasyou’dlike.30’’isfine.)Thisusuallygives106perμgforsupercoiledplasmid,butyoucanincreasetheefficiencybylettingthecells&DNAsitoniceabout30minbeforetheheatshock.Solutions:TsfⅠ30mMKOAc50mMMnCl2orMgCl2100mMKCl10mMCaCl215%glycerol(w/v)pHto5.8with0.2MAceticAcid(IfyouovershootthepHtolessthan5.8thendiscardandbeginagain.)TsfⅡ10mMNa-MOPSpH775mMCaCl210mMKCl15%glycerol(w/v)很好用,效率很高,同时省去了钙转或电转的麻烦大肠杆菌质粒提取1.过夜培养的菌液倒入1.5ml离心管中，离心，13000rpm，30sec；2.倒去管中上清液，在沉淀中加入100μlSolutionⅠ，振荡至彻底悬浮，（以使沉淀与SolutionⅠ充分混合），室温静置10min；3.加入200μlSolutionⅡ，立即温和颠倒离心管5-10次以混匀，冰上静置5min；4.加入150μlSolutionⅢ，立即温和颠倒离心管5-10次以混匀，冰上静置10min；5.13000rpm离心5min，把上清液小心移入另一新的离心管中；6.加入400μl苯酚，混匀，室温静置5min；7.13000rpm离心3min，将上清液吸至另一新的离心管中；8.加入400μl氯仿，混匀，13000rpm离心30sec，取出下相，弃之；9.重复上一步骤；10.在上清液中加入上清液1/20体积的5MNaCl和上清液2倍体积预冷的无水乙醇，13000rpm离心10min；11.此时在离心管底部出现白色的沉淀，小心地倒出上清液，用1ml70%乙醇清洗沉淀；12.13000rpm再次离心5min，倒掉上清液，用真空机使沉淀干燥；13.加入TE（pH=7.4，含20μg/mlRNaseA）缓冲液，使质粒溶解于其中，37℃水浴30min后可直接用于酶切，或贮存于-20℃中。注：SolutionⅠ：0.9克葡萄糖、2.5mlTris(1.0M,pH=7.5)、2.0mlEDTA(0.5M,pH=8.0)三者用无菌水定容至100ml，高压后使用。使用前加入溶菌酶，使其浓度为5mg/ml。SolutionⅡ：200μl,10MNaOH、1ml10%SDS与8.9ml无菌水混合。现配现用，贮存时间不超过一周。SolutionⅢ：26.5克醋酸钾用冰乙醇调至pH=4.8，再用无菌水定容至100ml.时间可能是久了点，但是蛋白质去的很干净，而且也基本上看不到RNA，效果很好，切出来的带很漂亮质粒DNA的提取纯化（碱法）1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中,12000g离心5!。2、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡)3、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡).NAOH,必须新鲜。4、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5分钟,12000g离心10分钟。加入溶液2后，迅速加入，中和碱性，避免基因组dna断裂。--20预冷的除，效果更好蛋白。5、上清液移入管中,加入等体积的氯仿，静置5分钟。12000g离心10分钟。6、将水相移入管中,加入2倍体积的无水乙醇,温和混匀后置于-20℃冰箱中20分钟。12000g离心10分钟。7、弃上清,加入500ul70％乙醇洗沉淀一次,5000g离心3分钟。8、重复79、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥5分钟10、将沉淀溶于20μldd水中，储于-20℃冰箱中。[注意]1，提质粒无需低温。第一步，菌液必须吸取干。2、NAOH必须新鲜3，加溶液2后迅速加入溶液3，避免2对基因组DNA的破坏。4，溶液3，最好-20冷却，有利沉淀形成，放置5分，冰欲。5，不用酚氯仿抽提。直接加等体积氯仿。静置5分钟6，2体积无水乙醇的效果好于1体积的异丙醇的效果7，除蛋白，最好70%乙醇洗涤2次。轻轻打起沉淀。8，做酶切，最好加dd水。碱裂解法制备质粒原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。为了方便理解，这里罗列一